基因克隆中蓝白筛选详细过程.docVIP

1载体连接及蓝白筛选 在微量离心管中配置下列DNA溶液，全量5ul。 pMD 19-T Vector 1 0.5ul Insert DNA 3 2ul Solution 1 2.5ul 2、16℃ （提前打开水浴锅，打开超净工作台，同时灭上1ml的枪和枪头）全量5ul，加入50ul感受态细胞。（加感受态细胞要慢慢吸取慢慢打出，同时不要离开冰太长时间） 冰中放置30min。 42℃ 加入890ul SOC（LB+Amp）培养基，37℃ 取出，先用酒精擦拭手，操作台和管子，点燃酒精灯，打开培养皿，将边沿在酒精灯上烤一下，将混合液倒入培养皿中，摇动培养皿铺匀，然后拿起推子，在酒精中灭菌，放在酒精灯上烤一下，冷却后在培养皿中来回推上几次，以混匀，之后凉10min左右，再次推匀，凉一会。 封口，放在37℃ 提前准备好（LB+Amp）培养基，和灭菌的锥形瓶，蓝白菌落长出来后，先用酒精灯擦拭手，桌面，及锥形瓶表明，LB+Amp倒入锥形瓶中适量，打开板子，酒精稍瓶口和镊子，用镊子夹起牙签，挑单独的，长得较圆的菌落斑，放入锥形瓶中，封口，标记。 摇菌，37℃ 溶液配置 配置200ml LB 培养基 Tryphone（蛋白胨/胰蛋白胨） 2g Yeast Extract（酵母菌提取物） 1g NaCL 2g 加入200ml蒸馏水，加40ul 5N 的NaOH ，称取3g Agar 加入锥形瓶中，提前用报纸 包好10-12个培养皿，放在高压蒸汽锅中 121℃ 配置Ampicillin (氨苄青霉素) 5ml 取0.5g Ampicillin 倒入10ml离心管中，用5ml蒸馏水溶解。 用0.22um过滤膜过滤至2ml离心管中（在超净工作台上进行） X-Gal 5ml 取0.1gX-Gal溶于5ml DMF（二甲基甲酰胺） 用用0.22um过滤膜过滤至2ml离心管中（在超净工作台上进行） IPTG 5ml 取0.12g 溶于蒸馏水中。同上 注：2、3、4分装完毕后放在-20℃ 待LB温度降至60℃ SOC培养基 配置250mM KCL溶液 在90ml去离子水中溶解1.86g KCL后，定容至100ml。 配置2M MgCL2溶液 在90ml去离子水中溶解19gMgCL2后，定容至100ml，高压灭菌。 配置100mL溶液 Tryphone（蛋白胨/胰蛋白胨） 2g Yeast Extract（酵母菌提取物） 0.5g NaCL 0.05g 加入80ml去离子水，充分搅拌，加入1ml 250mM KCL溶液，滴加5N NaOH溶液（20ul），将pH调节至7.0，定容至100ml，高温高压灭菌，4℃ 使用前加入0.5ml灭菌的2M MgCL2溶液。 注：以上是SOB培养基 配置1M葡萄糖溶液 将18g葡萄糖溶于90ml去离子水肿，充分溶解定容至100ml，用0.22um滤膜过滤除菌。 向100ml SOB培养基中加入除菌的1M葡萄糖溶液2ml，均匀混合。4℃