医学生物化学基础及技术 2.吸附层析 项目四2.吸附层析.pptVIP

* * 聊城职业技术学院 王辅明 生物化学基础及技术 职业教育医学生物技术专业教学资源库 吸附层析技术 吸附层析技术 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。 吸附层析在各种层析技术中应用最早，由于吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单 ，又具有一定的分辩率等优点，故至今仍广泛使用。 例如：纯水、医药用水和药液的制备过程中，经常用活性炭填充的吸附柱来吸附水和药液中的一些杂质，尤其是有色物质。也可以用于氨基酸、肽、糖类、脂类、苷类等物质的分离、鉴定。 凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的，而固体表面的分子所受的力是不对称的。 向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外的一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。本节主要介绍吸附柱层析。 一、吸附柱层析 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。 混合物中不同的物质，由于吸附力与解吸附力不同，在柱内的移动距离也不同。吸附力弱而解吸附力强的物质，在柱内移动距离较大，经过一定时间后，较早从柱内被洗脱下来，从而得到分离。反之，吸附力强而解吸附力弱的物质，在柱内移动距离小，较慢从柱内被洗脱下来。例如有A、B、C三种组分，A组分与吸附剂吸附力最弱，C组分与吸附剂的吸附力最强，若将A、B、C三种组分上柱分离，则A组分最先流出层析柱，C组分最晚流出层析柱，B组分居中，洗脱曲线或层析图谱(?Chromatogram)如图所示。 在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。 如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。 (一) 吸附剂的选择 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择哪种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。 羟基磷灰石 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。 使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按1∶6体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积