免疫细胞的分离和保存技术.docxVIP

免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测 定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细 胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细 胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也 异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（ mononuclearcell）,其 中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte）,有的则需分离T细胞和B细胞以及其 亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高 活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘 附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗 原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约 600?1000:1，两者的比重不同其沉降 速 度 亦 异 ， 通 常 用 两 种 方 法 加 以 分 离 。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用 肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤 维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温 30? 60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细 胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后 加入少量蒸馏水或含氯化铵的 Gey 溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂 解 ， 经 过 反 复 洗 涤 可 得 纯 度 较 高 的 白 细 胞 悬 液 。 （ 二 ） 聚 合 物 加 速 沉 淀 法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮 （polyvinylpyrolidone , PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与 白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他 细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为 1.090左右，而淋巴细胞和单核 细胞密度为 1.075?1.090，血小板为 1.030?1.035。为此利用一种密度介于 1.075? 1.092 之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度 的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有 Ficoll 和 Percoll 两种。 （一） Ficoll分层液法 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖 聚合物称聚蔗糖（商品名为 Ficoll），分子量为 40kD，具有高密度、低渗透 压、无毒性的特点。高浓度的 Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用 60g/L的低浓度溶液，密度为1.020,添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin） 以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层 液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分 离人外周淋巴细胞以密度为1.077 ±.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为 1.093,粒细胞密度为1.092,单个核细胞在 1.076?1.090之间。而不同动物血 中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为 1.088,马为1.090。 分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以 Hanks液或PBS液作适当 ?稀障的血浆单个孩细胞—伶离液稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心 后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图 20-1 ）。 ?稀障的血浆 单个孩细胞 —伶离液 ?红須胞 红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到 Ficoll而凝集成串钱状而 沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单 个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤 高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达 95%，淋巴细胞约占90%?95%,细 胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过 25E时会影响细胞获得率。 （二） Percoll分层液法 这是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮（PVP） 处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用 Percoll液经高速离心后形成一个连续密 度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用 Percoll原液（密度1.135）与约等 量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底 到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备