谷胱甘肽(GSH)含量测定.docVIP

谷胱甘肽（GSH）含量测定 一、实验目的 1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程; 2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 二、实验原理 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。 谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 三、实验材料 小麦幼嫩叶片 四、实验方法及步骤 制作标准曲线 取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线； 试管号 1 2 3 4 5 6 7 GSH标准液（10ug/ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 补水到2ml 2 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1 磷酸缓冲液（PH=7） 4 4 4 4 4 4 4 DTNB试剂 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度（ug/2ml） 0 1 2 4 6 8 10 2.样品测定 a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液； b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。 3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs) 注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量 Vt---样品提取液总体积(ml)； Vs----显色时所取样的体积(ml)； FW---样品鲜重（g）。 五、实验结果 1.标准曲线 样品测定结果 试管号 1 2 3 吸光度 0.048 0.05 0.046 GSH浓度（ug /2ml） 0.724 0.754 0.694 GSH含量（ug/g） 10.86 11.31 10.41 GSH平均含量（ug/g） 10.86 注意事项 使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。 在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。 在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。