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Q Sepharose XL填料使用说明 填料特性 表1. Q Sepharose XL 填料的特性 离子交换树脂的类型 强阴离子交换树脂 离子容量 0.18-0.25mmol Cl-/ml填料 基质结构 6%的交联琼脂糖与葡萄聚糖 颗粒类型 球形，45-165μm 平均颗粒尺寸 90μm 化学稳定性 - 稳定于所有常见的水性缓冲液 - 1M NaOH - 20%乙醇 - 6M 盐酸胍 避免： - 长时间（一周，20℃）暴露在PH4的环境中 - 氧化剂 物理稳定性 可忽略由PH和离子强度改变引起的体积的变化 推荐PH工作范围 2-12 原位清洗pH承受范围 2-14 推荐工作流速 300-500cm/h 结合容量 130mg牛血清蛋白/ml填料 稳定温度 4-40℃ 存储 20%乙醇 装柱建议与指导 推荐色谱柱 XK 16/20（16mm ID）截面积2cm2，柱高15cm时对应柱体积为30ml。 XK 26/20（26mm ID）截面积5.3cm2，柱高15cm时对应柱体积为80ml。 实验室规模色谱柱的填装（XK 16/20和XK 26/20） 组装色谱柱（和装柱器，如有必要）。 用装柱缓冲液冲洗尾端和柱头以除去色谱柱死腔中的空气，确保没有空气残留于柱网中。关闭柱子出口，并用装柱缓冲液覆盖柱网。 通过摇晃存储容器将填料重悬（不要搅动沉淀的填料）。混合填料和装柱缓冲液形成50-70%的混悬液（沉淀柱床体积/混悬液体积=0.5-0.7）。 将混悬液一次性连续倒入色谱柱。倾倒混悬液时用玻璃棒抵住色谱柱内壁引流可以最大程度地减少气泡的产生。 如果使用装柱器，立即用装柱缓冲液将色谱柱和装柱器的剩余部分填满。装上柱头或装柱器盖子，并将色谱柱与泵相连。避免柱头或进液管内存有气泡。 打开色谱柱底部出口，设定合适的泵流速并运行。理论上，Sepharose XL填料的初始装柱流速为250cm/h，直到填料沉淀稳定。 当柱床稳定后，关闭阀门并停泵。 如果使用装柱器，断开装柱器并在柱子上安装柱头。 保持柱头进液管断开，将柱头向推入以稳定好的柱床内约2mm，允许填充液从柱头进口管涌出。 连接泵，打开色谱柱底部出液口，继续以600cm/h的速度装柱15min。柱床将进一步压缩，柱床表面和柱头之间会产生一个小缝隙。 断开色谱柱进液口，将柱头压入柱床内约2mm。装柱完毕。 生产规模色谱柱的填装 装柱效果的评估 为了检验装柱质量和监控色谱柱在使用过程中的质量，需要在装柱之后、装柱后定期或分离效果变差时进行柱效检测。 表达填充柱效果的最好方法是理论台板高度（HETP）和不对称因子（As）。这些值可以很容易地用某些样品测定出来，如用1%的丙酮。也可以用氯化钠作为测试物。用2.0M NaCl水溶液作为样品，以0.5M NaCl水溶液作为洗脱液。 必须要注意的是，计算出的塔板数会随测试条件的不同而变化，因此只能作为参考值。同样重要的是，条件和设备要保持不变，这样结果才具有可比性。溶质、溶剂、洗脱剂、样品体积、流速、液体通路、温度等条件的变化都会对结果产生影响。 为了得到理想的结果，样品体积最大不能超过2.5%的柱体积，流速在15-30cm/h之间。如果定义了可以接受的柱效限值，那么塔板数可以用作色谱柱使用的验收标准。 HETP和As的测量方法： 为了避免样品的稀释，尽可能的在色谱柱进口处进样。 条件： 样品体积：2.5%的柱体积 样品浓度：1.0% v/v 的丙酮 流速：15cm/h UV：280nm，1cm，0.1AU 由UV曲线（或者电导曲线）计算HETP和As： HETP=L/N N=5.54(Ve/Wh）2 其中： L=柱床高度（cm) N=理论塔板数 Ve=洗脱峰的距离 Wh=半峰宽 Ve和Wh在同一单元 为了便于比较柱子性能，经常采用换算理论台板高度（reduced plate height）的概念。 换算理论台板高度的计算方法如下： HETP/d 其中： d为填料颗粒的粒径 作为指导原则，一个3的值通常是可以接受的。 峰形应该是对称的，不对称因子应尽可能的接近1（0.8-1.5之间的值通常是可以接受的）。峰型的变化通常是使用过程中柱床质量变差的第一个指示。 色谱峰不对称因子的计算： As=b/a 其中： a：10%峰高处的前半峰宽 b：10%峰高处的后半峰宽