原位杂交术原理及其的应用.pptVIP

原位杂交技术 in situ hybridization 核酸分子杂交技术 心在研究DNA分子复制原理的基础上发展起 来的一种技术。两条核苷酸单链片段,通 过氢键结合,形成DNA_DNA、 DNA-RNA或 RNA-RNA双链分子 心按其作用方式可大致分为两种:固相杂交 和液相杂交 今液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游 离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附 杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复 性速率液相分子杂交等 心固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在 固体的支持物上(常用的有硝酸纤维素滤膜, 其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另 一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相 杂交包括: ◇菌落原位杂交( co l ony in situ hybr idizat ion)、 今斑点杂交( Dot blot)、 心 Southern印迹杂交( Southern blot 今 Northern印迹杂交( Northern blot) 心组织原位杂交( Tissue in situ hybr idizat ion 即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学 技术 原位杂交技术的基本原理 ☆利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过 碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区, 形成杂交的双链 1.两条核苷酸单链片段,在适宜的条件下,通过氢键 结合,形成 DNA-DNA、 DNA-RNA或 RNA-RNA双键分 子 2.应用带有标记的(有放射性同位素,如3H、35S 32P,荧光素、生物素、地高辛等非放射性物 质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细 胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示,在光镜或电镜下观 察目的mRNA或DNA的存在与定位 ICgA TCG C-DNA Vector Transcription SP6 T7 T3 polymerase Dige*ingain Biotin PAP AIGCUAIGC GRNA UCGAluc G m-RNA 用原位杂交术,可在原位研究细胞合成 某种多肽或蛋白质的基因表达。 ◇此方法有很高的敏感性和特异性,可进 一步从分子水来探讨细胞的功能表达及 其调节机制。已成为当今细胞生物学 分子生物学研究的重要手段 In situ hybridization Aromas gene The rat brain section 培养细胞 原位杂交组织化学技术发展 1961年,Hal液相核酸杂交技术 1969年,Gal和 IPardue用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞 的核仁中。 1969年, Buongiorno- Narde l|i和Ama| d i john利 用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因 定位,创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 ·0rth(1970)应用H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首 次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探 针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境, 又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 · Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成 功。 Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛 (DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原 性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高, 应用不够普遍。