讲座ppt - 2011全国分子细胞生物学实验技术培训班-课件.pptVIP

3.4 转染或感染目的细胞，表达shRNA 如果目的细胞质粒转染效率低（小于60%）： 腺病毒载体： 高转染效率、高表达效率、使用方便。 约85%的基因治疗临床项目采用的均是病毒 载体（其中将近一半使用的是腺病毒载体）。 腺病毒包装体系 Adeasy系统：利用细菌重组；重组率较高，病毒滴度低。 Admax系统：Cre/loxP，293细胞内重组，同源重组率较低。 Adeno-X系统：PI-SceⅠ、I-CeuⅠ酶切连接。 BLOCK-iT? Adenoviral RNAi Expression System： Invitrogen，Gateway LR体外重组技术。 重组效率高，快速简单，筛选方便； 对感受态要求较高；载体较贵。 推荐 慢病毒包装体系 三质粒系统 四质粒系统 慢病毒表达载体、gag/pol、REV、VSV-G 慢病毒表达载体 4.5 检测或验证RNA干扰效果 mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR 蛋白质水平：Western-blot、免疫荧光 细胞表型水平： Hoechst 33258染色（细胞凋亡）； DAPI（细胞凋亡）； TUNEL（细胞凋亡）； MTT（细胞增殖）； 流式细胞检测（细胞周期与凋亡）； 细胞小室实验（细胞侵袭转移能力） 4.6 RNA干扰回复实验 RN