水解酶及及氧化还原酶组织化学原理及的方法.pptVIP

水解酶及氧化还原酶组织化学 原理及方法 水解酶 hydrolases 指催化底物发生水解反应的酶类 例如:磷酸酶类、酯酶类等 AB+H,O酶AH+BoH 磷酸酶类 磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称 水解磷酸酯键,释放磷酸离子,为重金属捕 获而产生沉淀;或释放荼酚而为重氮盐耦联 而显色。 碱性磷酸酶:在pH9294表现为最大活性 酸性磷酸酶:在pH5.0显示最大活性 显示法 金属沉淀法 ·偶氮耦联法 碱性磷酸酶 alkaline phosphatase, AKP ALP 在碱性范围,催化各种醇和酚的磷酸酯水解。 酶 R-O-P-OH +HO= ROH +HO-P-OH 磷酸和R能用组化方法捕获 ·钙钴法:捕获磷酸 ·偶氮耦联法:当R为萘酚衍生物时,捕获R ·二者最终均形成有色沉淀,可作定位观察。 激活:金属离子—Mg2、Mn2+、zn2+、Co2+ 抑制: Tetramiso(四咪唑)、各种醇类、L半胱氨 酸 钙钴法(金属沉淀技术) Gomori- Takamatus法 原理:把游离的磷酸变为盐的形式从而产生 沉淀 ·β-甘油磷酸钠(底物)一磷酸离子 ·磷酸离子+Ca2+一→磷酸钙(不可见) ·磷酸钙+Co2+一→磷酸钴(不可见) 磷酸钴+S2一→硫化钴(不溶,可见) 条件:pH94 作用液 ·2%巴比妥钠 ·3%β-甘油磷酸钠 2%无水氯化钙 ·2% Mgso7H20 步骤 新鲜恒冷箱切片,8 不固定直接进作用液 FCa(氯化钙 Formalin)固定5-2h,4C,固定后 蒸馏水洗 ·作用液10-60,37°C(视组织而定) 流水5 2%硝酸钴5 蒸馏水洗 1-2%硫化铵1(*硫化铵需新鲜配制) 蒸馏水洗 ·甘油明胶封 结果:黑色的颗粒状沉淀 对照: ·去底物(以双蒸水替代β-甘油磷酸钠),结果阴 性 进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使 酶失活 注意:组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色 沉淀,应鉴别(铁反应)