PCR实验室操作的流程纲要.docxVIP

v1.0 可编辑可修改 乙型肝炎病毒 (HBV DNA PCR ABI7300) 检侧标准操作程序 一、 INFORMATIONFORTEST检测信息 项目名称 乙型肝炎病毒核酸 方法 聚合酶链反应 方法依据 卫生部《全国临床检验操作规程》 第三版（2006） 第七篇第六章第一节 二、 ANALYTICALPRINCTPLE检测原理 聚台酶链式反应 (PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量 PCR技术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使 用 TaqMan荧光探针的检测原理： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一 个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时， Taq 酶的 5’一 3’外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一） 。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 三、操作步骤 （一）试剂配制 1 v1.0 可编辑可修改 1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出 HBV-DNA检测试剂盒。查看外包装盒 ( 包括生产批号、有效期 ) ，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及 Taq 酶( 核对核酸提取液、 HBVPCR反应液及 Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致 )（图 1），不一致则不可使用，需更换新的试剂。室温平衡 20min，完全融化后 2000rpm离心备用。 2、核酸提取液的分装 1）取离心管架置于超净工作台内 ( 开机前用紫外线消毒 30 分钟 ) ，用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外 壁，不能碰到管内壁 ) ，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为 n(n= 样本数 +对照品 +质控品 ) 。完成后将镊子放回原位（图 2）。 2 v1.0 可编辑可修改 2）用移液器准确吸取核酸提取液 50ul 分装至离心管中 ( 左上角第一排开始，从左住右依次加入）。因核酸提取液内含固体沉淀颗粒物，为使颗粒均匀分布， 故每次取样时都要用移液器反复吸打 3-4 次（图 3）。分装完毕后将移液器量程归位。 3）加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺序为：从右下角第一个开始，从右住左依次盖上（图 4），离心管盖全部盖完后，通过传递窗转移至标本处理区。 3 v1.0 可编辑可修改 3、HBV-DNA反应液的配制 每批需设置空白对照、阴性对照、临界阳性对照（同时检测低值阳性质控品，则无需再检测临界阳性对照〕 、阳性质控品、阳性标准品。所需每批需配制数 n=样本数 +对照品 +阳性标准品 +质控品，每个测试反应体系配制如下表： 试剂 HBV PCR反应液 Taq 酶 用量（ ul ） 1）每盒 HBV-DNA试剂可检测 32 人份，根据每日需检测标本份数计算出每批所需 HBVPCR反应液和 Taq酶用量（例有 111 人份需要进行检测，则有 3 盒试剂可直接使用 10ul 移液器将 Taq 酶加入 HBV PCR 反应液中，另有 111-3*32=15 人份试剂需将 HBVPCR反应液和 Taq 酶使用移液器按反应体系比例吸取至离心管中配制（图 5）。 4 v1.0 可编辑可修改 2）取出离心后备用的 HBV PCR反应液和 Taq 酶，按上述要求配制后用旋涡振荡器振荡混匀 5-10sec ，然后再用离心机 2000rpm 离心 10sec 备用（图 6）。 3）从操作台面上拿取 HBV-DHA试剂配制盒 ( 可选用空余的 200u1 枪头盒 ) 至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按 顺序编号（图 7）。编号规则为：样本扩增反应管对应的孔位按相应的样本流水号编写、阳性质控品反应管对应的孔位编“ Q”（如有高值则标为 H，低值为 L) ，阴性对照品孔位编“ - ”，临界阳性对照对应的孔位编“±”，空白对照对应的孔位编“ B”，1 号标准品对应的孔位编“ S1”，2 号标准品对应的孔位编“ S2”，依此类推。 5 v1.0 可编辑可修改 4）编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管 (ABI7300 使用的是八联一薄壁反应管，镊子应夹住反应管外壁，不可接触到内壁。按（图 8）所示方向依次将所有反应管 ( 反应管数 =n)隔列