上海市腹泻病监测技术方案2.docx

上海市腹泻病监测的实验室检测标准操作程序 第一部细菌学检测的技术方案 一）霍乱弧菌检测操作程序 1?标本检测流程图： 2.操作步骤： 2.1增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约 0.5g）,放入碱性蛋白胨水（APW）培 养基中36 增菌6-8h。 2.2分离及二次增菌：增菌后从菌液生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划 线接种于双洗平板，TCBS或弧菌显色平板。37C培养18?24h后，选择单菌落 做血清凝集实验。标本含菌量少时，为提高检出率，实行 2次增菌，取第1次碱 胨水增菌6h?8h的培养物的表层液0.1mL?0.2mL,接种于8mL?10mL的碱胨 水中，37T培养6h?8h再做分离。 2.3血清学鉴定：从平板上挑取可疑菌落 5-10个。双洗平板上为湿润、黑芯、光 滑菌落。TCBS上为黄色发亮、表面光滑、稍凸起的菌落。弧菌显色平板上为蓝 色，菌落中心略有凹陷的菌落（注意该平板上可疑菌落易发生自凝） 。取少许培 养物（TCBS和弧菌显色平板上的疑似菌落需转种到营养琼脂小斜面或非选择性 平板后进行血清学鉴定）与 01群+0139群霍乱多价诊断血作玻片凝集试验，如 很快出现肉眼可见的明显凝集即为阳性反应， 阳性者必须用生理盐水按同样方法 作对照试验，以排除因自身凝集而导致的假阳性反应。并继续用小川和稻叶单价 血清分型。对01群不凝集的可疑菌落，再用 0139群诊断血清作玻片凝集。 2.4生化鉴定：在双洗平板、TCBS琼脂或弧菌显色平板上的疑似菌落转种在普 通琼脂平板上，选取单菌落做生化初筛，选择单菌落做 KIA和MIU实验。进一 步生化鉴定选用梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化鉴定 仪鉴定。具体操作按产品操作说明。 2.5 PCR检测：可使用商品化的试剂盒或按照合成引物及探针后进行 PCR检测。 2.5.1 01和0139双重实时PCR验证检测，引物和探针序列见表 1和表2： 表2 01和0139双重实时荧光PCR检测的引物及探针 引物名核苷酸序列（5?3 产物长度 称 （bp） 01 F GGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG 117 01 R TAGAGACTCACCTTCGATTTCAGC 01 P FAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1 0139 F CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG 104 0139 R TCCCTTTCCACCTCGGTATTTC 0139 P HEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1 反应体系和反应条件为：20卩匚反应体系，2X PCR buffer 10卩L , 01基因上下游 引物（10卩mol/L各0.4叮 探针（10卩mol/L） 0.4卩；0139 rfb基因上下游引物 （10卩mol/L 各 0.4探针（10卩mol/L 0.4卩；去离子水5.6 DNA模板2卩1。 循环条件为：95r 30s, 95C 5s和60C 20s循环40次，在退火阶段检测荧光。 2.5.2霍乱弧菌毒素基因（ctx）检测，见表2： 表2 ctx毒素基因的荧光PCR检测的引物及探针 引物名称 核苷酸序列（5?3 产物长 度（bp） CT1 R TACATCGTAATAGGGGCTACAGAG CT1 P FAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG -BHQ1 反应体系和反应条件为： 20 ^L反应体系，2X PCR buffer 10卩L ,上下游引物 (10卩mol/L各0.4探针(10卩mol/L0.4 uL去离子水6.8 DNA模板2卩1。 循环条件为：95C 30s, 95C 5s和60C 20s循环40次，在退火阶段检测荧光。 3.报告结果及上送菌种：报告粪便标本中检出霍乱弧菌，保存并上送菌种。 二）沙门菌检测操作程序 标本检测流程图： 操作步骤： 2.1增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g）,放入SBG增菌培养基中36±C 增菌 18-24h。 2.2分离：取增菌培养液一环接种沙门菌显色培养基上 36±°C培养过夜； 2.3挑取可疑菌落：挑取可疑菌落（如科玛嘉沙门菌显色平板上，目标菌落紫色、 淡紫色菌落；SS平板上周边无色透明、中心黑色菌落）转种双管糖或其他生化 筛选培养基（如 KIA、MIU ）, 36 ±1 C培养过夜； 2.4生化初筛：挑取双糖管结果为发酵葡萄糖产酸、产气，甘露醇 +,尿素-， H2S+/—，动力+,靛基质―，蔗糖—的反应管菌株，或 KIA、MIU的生化结果 为K/A,产气+，H2S+/—，动力+,靛基质―，尿素—的反应管菌株转种于哥伦比 亚琼脂平板及营养琼脂小斜面，分别进行血清学鉴定及生化鉴定。 2.5血清学鉴定：凡生化初筛结果符合沙门菌属的