高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总..pdfVIP

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总 1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20 分钟。 3. 打开HPLC 工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4进入HPLC 控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的 出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual 菜单下，先点击purge，再点击start，冲 洗时速度不要超过10?ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要 超过2000 。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7. 设计走样方法。点击 file，选取 select?users?and?method ，可以选取现有的各种走样方 法。若需建立一个新的方法，点击new?method 。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器 等，根据需要而不同。选完后，点击protocol 。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳 流，一般2-5 分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject 转换；d.走样时间，随不同的样品 而不同。 8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完 后，点击 postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线， 洗掉剩余物。 9． 填写登记本，由负责人签字。 10． 流动相均需色谱纯度，水用20m 的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引 起气泡。 11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 12． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。 13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 选择波长要从以下几个方面考虑： 1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适 的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测 灵敏度下降。 2. 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的。所以只要选择一个对大多数组分都 有较大吸收的波长就可以了。3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。 254nm 对 常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲 醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。 一、液相色谱流动相的性质要求 :一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测 器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。 选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k 降低； 而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成 的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面： ①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某 些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸 性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相 通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。③必须与检测器匹配。使用UV检测器时， 所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光 系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。 ④粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂 会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点 在100℃以下的流动相。 二、液相色谱流动相的pH值 采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相 的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相 离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的 pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相 中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和 1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流 动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和 30mmol/L三乙胺溶液。 注：流动相 中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。