上海市腹泻病监测关键技术专项方案.docxVIP

上海市腹泻病监测试验室检测标准操作程序 细菌学检测技术方案 一）霍乱弧菌检测操作程序 1. 标本检测步骤图： 粪便或 粪便或肛拭子 可选：APW增菌液36℃±1℃ 2次增菌 可选：APW增菌液36℃±1℃ 2次增菌6h-8h 36℃±1℃ 18-24h 双洗平板 TCBS平板 弧菌显色平板36℃±1℃ 18-24h APW增菌液36℃±1℃增菌6h-8h 挑取可疑菌落 挑取可疑菌落5-10个，用霍乱弧菌O1/O139多价诊疗血清进行玻片凝集 O1群（小川和稻叶）及 O1群（小川和稻叶）及O139群 霍乱弧菌 霍乱弧菌O1，O139菌体抗原及CTX基因PCR检测 上报 上报市疾控深入判定 . 2. 操作步骤： 2.1 增菌：用无菌拭子采集少许粪便（约0.5g），放入碱性蛋白胨水（APW）培养基中36±1℃增菌6-8h 2.2分离及二次增菌：增菌后从菌液生长最茂盛菌膜下表层，取一接种环，划线接种于双洗平板，TCBS或弧菌显色平板。37℃培养18～24h后，选择单菌落做血清凝集试验。标本含菌量少时，为提升检出率，实施2次增菌，取第1次碱胨水增菌6h～8h培养物表层液0.1mL～0.2 mL，接种于8 mL～10 mL碱胨水中，37℃培养6 h～8 2.3血清学判定：从平板上挑取可疑菌落5-10个。双洗平板上为湿润、黑芯、光滑菌落。TCBS上为黄色发亮、表面光滑、稍凸起菌落。弧菌显色平板上为蓝色，菌落中心略有凹陷菌落（注意该平板上可疑菌落易发生自凝）。取少许培养物（TCBS和弧菌显色平板上疑似菌落需转种到营养琼脂小斜面或非选择性平板后进行血清学判定）和O1群+O139群霍乱多价诊疗血作玻片凝集试验，如很快出现肉眼可见显著凝集即为阳性反应，阳性者必需用生理盐水按一样方法作对照试验，以排除因本身凝集而造成假阳性反应。并继续用小川和稻叶单价血清分型。对O1群不凝集可疑菌落，再用O139群诊疗血清作玻片凝集。 2.4生化判定：在双洗平板、TCBS琼脂或弧菌显色平板上疑似菌落转种在一般琼脂平板上，选择单菌落做生化初筛，选择单菌落做KIA和MIU试验。深入生化判定选择梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化判定仪判定。具体操作按产品操作说明。 2.5 PCR检测：可使用商品化试剂盒或根据合成引物及探针后进行PCR检测。 2.5.1 O1和O139双重实时PCR验证检测，引物和探针序列见表1和表2： 表2 O1和O139双重实时荧光PCR检测引物及探针 引物名称 核苷酸序列（5’～3’） 产物长度（bp） O1 F GGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG 117 O1 R TAGAGACTCACCTTCGATTTCAGC O1 P FAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1 O139 F CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG 104 O139 R TCCCTTTCCACCTCGGTATTTC O139 P HEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1 反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCR buffer 10μL , O1 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；O139 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水5.6μL，DNA模板2μL。 循环条件为：95℃ 30s, 95℃ 5s和60℃ 20s 循环40次，在退火阶段检测荧光。 2.5.2 霍乱弧菌毒素基因（ctx）检测，见表2： 表2 ctx毒素基因荧光PCR检测引物及探针 引物名称 核苷酸序列（5’～3’） 产物长度（bp） CT1 F CTTCCCTCCAAGCTCTATGCTC 114 CT1 R TACATCGTAATAGGGGCTACAGAG CT1 P FAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG -BHQ1 反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCR buffer 10μL ,上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水6.8μL，DNA模板2μL。 循环条件为：95℃ 30s, 95℃ 5s和60℃ 20s 循环40次，在退火阶段检测荧光。 3.汇报结果及上送菌种：汇报粪便标本中检出霍乱弧菌，保留并上送菌种。 沙门菌检测操作程序 1．标本检测步骤图： 粪便或肛 粪便或肛拭子 挑取可疑菌落3-5个转种于初筛生化管 挑取可疑菌落3-5个转种于初筛生化管36℃±1℃ 18h-24h SBG增菌液36℃±1℃增菌18h-24h 沙门菌显色培养基或SS平板36℃±1℃ 18h-24h 对初筛生化符合