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抗菌活性测试步骤及实验器材 第一天中午 12 点 1、准备 9 个锥形瓶（1 个备用，4 个培养菌液，4 个稀释菌液），洗净，烘干 2、先在备用锥形瓶中配制 500ML 液体培养基，溶解后，倒入其余 8 个锥形瓶中，每瓶 50ML 。盖上半透膜，用绳或皮筋系住，在用报纸盖上一层，用皮筋系住。 液态培养基：蛋白胨 5g，酵母 2.5g，氯化钠 5g，水 500ML，按比例增减。 （半透膜） 第一天下午 3 点 3、将 9 个锥形瓶，200 μL 枪头两盒，10 μL 枪头，1ML 枪头，用报纸包住，放入灭菌 箱中，灭菌 20min 。121 摄氏度。 （灭菌锅） 第一天下午 4 点 4、配药液，按照 0.0010g—1ML，0.0020g—2ML，这种浓度配药液配出的浓度为 1000μg/mL,溶剂为 DMSO：水=1:1.等着全部溶解。 第一天晚上 6 点 1 5.稀释药液，将配制好的药液浓度为 1000，500，250，125 μg/mL，四个浓度梯 度。 第一天晚上 9 点 6、将超净台打开紫外灯灭菌 20min，点燃酒精灯，从灭菌箱取出4 个锥形瓶， 把接种环放在酒精灯上烧红，冷却几秒，从固体斜面菌落中划出一点，放在培养 基中，放入摇床（转速 131，温度 37 摄氏度）中培养 12 个小时。 （从左到右依次为接种环，超净台，摇床） 第二天早上 7 点 7、将超净台打开紫外灯灭菌 20min （需要灭菌的器材：96 孔板，枪，酒精灯； 放在超净台上即可）。将稀释好的药液加入到 96 孔板中，每孔加 10 μL （用从 灭菌器中取出灭过菌的 10 μL 枪头），横行 12 个孔，每种浓度的药液重复加 3 个孔；竖行 8 排，8 种药。每种菌要加一排阳性对照：即氯霉素 4 种浓度，每种 浓度重复 3 个孔，4 个浓度，正好横行一排 12 个孔。再加一排对照，其中 3 个 孔为溶剂 10 μL （无药空白对照），另三个孔只加菌液90 μL （阴性对照） （96 孔板，EP 管） 第二天早上 9 点——到 11 点 8、把摇床中菌液取出（浑浊即为菌长起来了），再把灭菌器中的另外 4 瓶培养 基和 1ml 的枪头取出，点燃酒精灯，用酒精喷壶，喷下试验台和手，进行灭菌。 从摇床取出的菌液中，吸取 1ml，放在 1 瓶培养基中，稀释 50 倍（50—100 倍均 可，看菌的浓度），[如果菌液长的很浓，则 20ML 培养基中加一滴菌液（用 200ul 2 的吸头, 一滴约 10 微升]，再取出 200 μL 的枪头，将稀释好的菌液，加到 96 孔 板中，每孔 90 μL，加完放在培养箱内培养 24 小时。（阴性对照孔只有 90 μL 菌液，未添加任何药液或溶剂） 第三天早上 7 点 9、配制MTT （现用现配，因为较难溶，一般提前1 夜配制，避光称量，避光配 制）： 溶质：MTT 溶剂：PBS 缓冲液，磷酸二氢钾 0.24g，磷酸二氢钠 1.44g，氯化钠 8.0g,氯化钾 0.2g，1L 蒸馏水（按比例增减） 用 PBS 配制 4mg/ml 的MTT，每孔加 10 μL 第三天早上 11 点 10、加完MTT，放在 37 度恒温箱中，培养 4 个小时。 （恒温箱） 第三天下午三点 11、3 小时后，取出，大概称量下 96 孔板的重量（使他们放在离心机中可以平 衡，相对的板质量差不可以超过 0.02 克）放在离心机中离心 3 分钟，3050RPM 3 MIN,离心结束后，甩掉上层清液（），用排枪在 96 孔板中每孔加入 150 μLDMSO （二甲基亚砜），轻摇5-30min 溶解，放在酶标仪中测量，得到数据。 3 （从左到右依次为排枪，离心机，酶标仪） 仪器：锥形瓶, 半透膜, 200 μL 枪头两盒，10 μL 枪头，1ML 枪头, 灭菌箱, , EP 管, 超净台, 接种环,酒精灯，摇床，96 孔板，枪，恒温箱，离心机，酶标仪。 药品：蛋白胨,酵母，氯化钠, DMSO，MTT，磷酸二氢