细菌膜囊泡间体介导H2O2外排的耐药机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 近年来，细菌耐药问题日渐严重，给抗感染治疗带来重大挑战。多种超级细 菌的出现，使耐药机制的深入研究迫在眉睫。本实验以野生型大肠杆菌MG1655 及其基因突变株为研究对象，筛选与膜囊泡间体介导过氧化氢外排的耐药机制相 关基因，并分析这些基因的突变株受到抗生素损伤后，其对间体介导的耐药机制 中的作用。主要研究内容及结果如下： 1）采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、纳米颗粒跟踪分析技术、生物透射电镜 和相色谱 串联质谱法分析离体间体的性状，数据显示离体间体的相对分子质量约- 13KDa 46nm 96 为 、粒径约为 ，且离体间体包含 种蛋白组分。 2）根据离体间体的蛋白组分和高通量转录组测序，筛选得到四个与间体介导 的耐药机制相关的基因，分别是水通道蛋白AqpZ、甘油 水通道蛋白- GlpF、甘油 磷酰二酯磷酸二酯酶GlpQ、外膜蛋白OmpA，并成功构建相应的突变株。 3）突变株的初步耐药实验结果显示，所筛选的四个基因对大肠杆菌的耐药性 有一定影响，突变株对庆大霉素的耐药性呈现基因缺失株敏感、过表达菌株耐受。 相比其他抗生素的结果 （诺氟沙星、氯霉素、头孢噻呋钠），呈现一定规律和趋 势。同时，结果表明5 μg/ml 庆大霉素作为损伤细菌和诱导细菌形成间体的合适 抗生素及浓度。 4）采用Image-ProPlus 图像软件统计胞外过氧化氢的积累量，表明aqpZ、 glpF 基因的过表达菌株胞外的过氧化氢积累量均显著高于对照组 （P 值分别为 0.008 0.046 AqpZ 和 ）。综合耐药实验结果和胞外过氧化氢水平数据，有力说明 和GlpF 通道蛋白在间体介导外排过氧化氢的耐药机制中发挥着重要的作用。 本课题对间体相关基因参与耐药机制的研究，为间体的进一步研究提供了的 理论基础，并为开发新型抗菌药物提供了策略。 关 键 词：过氧化氢；大肠杆菌；间体；耐药 论文类型：基础研究 选题来源：国家自然科学基金 I 目录 目 录 1 1 第 章 文献综述 1.1 活性氧的产生、功能及代谢1 1.2ROS及H O 参与抗生素的杀菌机制2 2 2 1.3 间体的形成与功能3 1.4 间体及H O 参与的耐药机制5 2 2 第2 章 离体间体的性状研究7 2.1 实验材料与仪器7 2.1.1 主要试剂7 2.1.2 主要仪器7 2.2 实验方法7 2.2.1 供试菌株7 2.2.2 抗生素胁迫诱导间体的产生及其粗提7 2.2.3 离体间体的提纯8 2.2.4NTA 技术观测离体间体8 2.2.5LC-MS/MS分析离体间体的蛋白组分8 2.3 实验结果与分析9 2.3.1 离体间体的SDS分析9 2.3.2 离体间体的TEM 观察9 2.3.3 离体间体的NTA 分析10 2.3.4 离体间体蛋白组分的LC-MS/MS分析 10 2.4 讨论15 3