提高外源基因在盐藻细胞中表达量的策略研究.pdfVIP

摘要 摘 要 目的：为了提高外源基因在杜氏盐藻（简称盐藻）细胞中表达量，本论文 从建立新型的盐藻自转化方法、采用细胞穿膜肽介导、联合细胞核定位肽应用等 策略，进行外源基因对盐藻细胞的转化工作，力求提高外源基因的表达量。在获 得高表达藻株的基础上，对转化株的遗传稳定性进行分析，最终制备高表达外源 基因遗传稳定的转化盐藻藻株。 方法：利用盐藻自身能够适应不同盐浓度的特性，当高盐浓度（1.0M）瞬 时变为低盐浓度（0.1M ）时，通过造成的渗透压差进行外源基因的转化工作。 细胞外成份通过表面活性剂作用形成的孔洞进入细胞，外源物质进入细胞后，采 用不同波长的荧光激发，在荧光显微镜下观察细胞核位置的荧光有无和强弱。没 有引入外源物质的盐藻组作为阴性对照，同样进行相同的操作处理。为了获得最 佳的转化结果，本论文对不同的转化参数进行了比较研究，对影响转化效率的四 个参数（转化时间、盐梯度、染料剂量和 TritonX-100 浓度）分别进行了优化， 观察不同转化参数对转化效率的影响，最终获得最高转化率的条件参数，供后续 实验所用。 在此最佳转化条件下，将含有外源基因的重组载体与细胞穿膜肽（TAT ）、 核定位肽（ SVT40 ）联合应用，即盐藻细胞分别采用单独质粒 （pCAMBIA1303 ）、质粒联合穿膜肽、质粒联合核定位肽进行转化，以期望获 得更高的转化效率和外源基因的表达量。实验同时设有阴性对照组（加入其它质 粒进行转化）和空白对照组（无质粒进行转化操作）。外源重组 DNA 进行盐藻 转化后，经过 72 小时培养后离心收集细胞。采用组织化学染色和 PCR 扩增分 1 摘要 析，检测外源基因（GUS 基因）在盐藻细胞中的表达情况。细胞染色后在高倍 镜下观察拍照，PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析和测序鉴定。同时，转化的 细胞进行 RT-PCR 扩增分析，鉴定外源基因（GUS 基因）在转录水平的表达情 况。利用荧光定量 PCR 方法在不同组别中（单独质粒转化组、质粒联合 TAT 组、质粒联合 SVT40 组）筛选出外源基因表达量最高的转化藻株。随后，用 Western blot 方法进行最高表达株的蛋白产物分析，以鉴定表达量和生物活性。 对于获得的最高表达株进行 3-6 个月的遗传稳定性分析，筛选获得高表达外源基 因的遗传稳定性藻株。 结果: 利用盐梯度的变化，成功建立起了盐藻的盐梯度自转化方法。通过 高盐浓度变为低盐浓度时，外源物质能够被自发的转入到细胞内部。结果显示： 外源性物质被引入细胞后，盐藻细胞的细胞核位置在不同的荧光激发下，分别呈 现红色和绿色强荧光；而阴性对照组细胞没有该荧光的发出，结果说明外源性物 质被成功自发的引入盐藻细胞。通过对不同转化参数的优化研究（包括转化时 间、盐梯度、染料量和 Tritonx- 100 浓度等），结果显示：在四个转化参数中， 盐浓度的变化对转化结果影响最大。第一，随着盐浓度由高到低逐渐降低时，转 化细胞的数量显著增加。但是如果盐浓度小于 0.1M ，由于细胞破裂严重，无法 统计转化情况；当盐浓度大于 0.5M 时，转化子的数量出现了明显减少的情况。 第二，转化时间从 60s 到 120s，转化细胞的数目显著增加。但是时间超过 120s 后，由于细胞大量破裂，转化细胞的数量并没有相应增加。第三，表面活性剂 0.1% TritonX-100 量从 2μl （在转化体系中浓度为0.0005% ）到 10μl （在转化体 系中浓度为 0.001% ）时，随着浓度的增加转化细胞的数目也明显增加。当 0.1% TritonX- 100 量超过 0.001%后，由于细胞大量破裂，转化细胞的数量并没有相应 2 摘要 增加。第四，外界荧光染料（EB ，1.25 mg/ml）在15µl 至30µl