壳聚糖在结核多肽纳米疫苗中的应用研究.pdfVIP

摘要 摘 要 结核病（tuberculosis ，TB ）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex ，MTC ）引起的一种慢性消耗性传染病，发病率和死亡率都 居各类传染病前列。目前用于临床预防结核病的唯一疫苗是卡介苗（减毒牛型结 核分枝杆菌活疫苗，BCG ），在临床应用过程中发现，接种卡介苗仅能部分保 护幼儿，且保护力随年龄增长而减弱，对成人无显著保护力。随着近年来结核病 疫情的再次攀升和新的流行特征的出现，迫切需要新型有效的结核病疫苗出现。 结核多肽疫苗是按照特殊的病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的 氨基酸序列，通过化学合成多肽制备疫苗。但是，由于合成多肽的结构特征改 变、半衰期短及表位多肽分子小、免疫原性较弱很难产生有效的免疫应答等原 因，寻找到合适的载体和佐剂使多肽产生有效免疫应答，是目前研究结核多肽疫 苗的主要瓶颈。 壳聚糖（chitosan ，CS ）具有来源广泛、价格低廉、安全无毒、具有良好的 组织相容性、可提高全身和局部免疫反应等优点，是一种潜在的多肽疫苗佐剂， 且已经成为世界范围内疫苗佐剂研究的热点。 本课题使用壳聚糖构建纳米载体，负载结核多肽，增强多肽的免疫原性，并 延长多肽在体内释放时间，更有效的激发机体特异性免疫应答。本课题具体研究 内容为：筛选并体外合成潜在的保护性结核抗原多肽。合成壳聚糖-脱氧胆酸双 亲性偶联物（Chit-DC ），并通过紫外图谱（UV ），红外光谱（IR ）及核磁共振 1 （ H NMR ）对Chit-DC 偶联物进行结构表征，通过自组装构建制备负载多肽的 纳米颗粒（Chit-DC-Peptides ），高分辨透射电子显微镜 （TEM ）观察 Chit-DC 和 Chit-DC-Peptides 纳米颗粒的微观形态及粒径。采用离子交联法制备合成壳聚 糖纳米颗粒（CS-NPs ）和载多肽纳米颗粒（Peptides-CS-NPs ），扫描电子显微 镜（SEM ）观察负载多肽前后的纳米颗粒的微观形态及粒径，动态光散射法 （DLS ）测定其流体力学直径，Zeta 电位法测定多肽负载前后电位变化。采用荧 光分光光度法测定负载前后多肽的含量，计算负载率、载药量并研究多肽体外释 放规律，最后选用离子交联法试制出结核多肽纳米颗粒疫苗。 利用试制疫苗进行小鼠动物试验。设置空白纳米组、PBS 组、纯多肽组、 多肽弗氏不完全佐剂组和多肽纳米颗粒疫苗组五组对照，每两周一次对小鼠皮下 免疫三次后，ELISA 法跟踪观察各组小鼠血清IgG 抗体变化。 结果表明，成功筛选并合 成两条结核 抗原多肽 Rv0180c: GLDKNKFDIRVVSPDEARRLY 和 Rv0227c: VSGTIVKETERANHYFARDP 。紫 I 摘要 1 外光图谱 （UV ）、红外光谱 （IR ）及核磁共振分析 （H NMR ）结果表明，脱 氧胆酸与壳聚糖发生了偶联，形成了 Chit-DC 偶联物。TEM 结果显示，Chit-DC 颗粒直径30~50 nm ，自组装法制备成的Chit-DC-Peptides 纳米颗粒为类球形，直 径在30~ 100 nm 之间。在离子交联法中，动态光散射法测得所得空白CS-NPs 的 平均粒径和PDI 分别为（148.13±2.24 ）nm 和0.197±0.013 ；4 ℃放置28 d ，粒径 未见显著增大。Peptides-CS-NPs 的平均粒径和PDI 分别为（186.93±8.80 ）nm 和 0.254±0.014 。Zeta 电位测定法测定负载多肽前后纳米颗粒的电位为 （+ 18.00±0.89 ）mV 和（+ 12.07± 1.68）mV ，纳米载体的负载率及载多肽量分别 为（45.20±2.95 ）