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JLB-RT区替换实验操作步骤
一、摇菌，提质粒
摇 pTriEx-1.1、pTriEx-C、RT 区克隆细菌 T-easy： Z31-9 (野生型)、Z20-9
.收集 1.5mL 菌液，lOOOOrpm 1-2min，弃上清。
.加入250讥溶液I，涡旋混匀。
加入250讥溶液II，颠倒混匀，静置 2min。
加入300讥溶液III，颠倒混匀，冰上静置 5min。
12000rpm 8min，取500 上清转移至柱子。
10000rpm 1min，弃滤液。
加入 washing buffer 500 至柱子，10000rpm 1min，弃滤液。
重复第7步。
12000rpm 空离 2min。
加入 40-50 止 Elution Buffer 作用 15-30min，换新 EP 管，12000rpm , 2min 收集滤液。
二、酶切质粒载体上的
RT区及T载体上的
RT区
1 x K Buffer:
2讪新的
10 x T
buffer 2ul
BSA :
2 1L
xba I
0.5ul
质粒：
10此
sph I
0.5ul
NcoI:
1 1L
质粒
5ul
Xhol:
1 1L
H2O
12ul
出0:
4 1L
总体积：20 1L体系，
37 C,酶切过夜
三、 电泳、胶回收 DNA
20 X酶切产物加loading buffer全上样，电泳后切胶回收 1250bp片段。
称重加入 500 ylQG (1g/3mL ) , 50C 水浴 10min 融胶。
将液体转移至柱子，10000rpm , 1min，弃滤液。
加入 500 卩 LQG 10000rpm , 1min，弃滤液。
加入 750(1LPE,静置 3min , 10000rpm , 1-2min。
13000rpm 空离 2min。
置一新 EP 管上，加入 15L Elution Buffer,静置 3min, 13000rpm , 1min，收集滤液备用。
四、 连接反应
10 XBuffer:
1.5
1L
T4连接酶：
1.5
1L
pTriEx 载体:
1.5
1L
回收DNA :
4.5
ML
H2O:
6 i
L
2 ?每管连接管加入 50 X感受态细菌（冰上操作），冰浴20min.37 C预热SOC培养基。
3. 42 C 热击 1min。冰浴 2min。
4 .加入350 上述步骤预热的 SOC培 养基
37C 130 rpm 复苏 1h。
200卩1板涂菌。
37C 培养 16h。
六、 取单一菌落，摇菌，提质粒，然后酶切，酶切后，取质粒和酶切产物一起跑电泳，看条 带是否正确，然后取正确的送测序，直接送质粒即可。
七、 测序
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