凯基caspase2分光光度法检测试剂盒说明指导书.docVIP

凯基Caspase-2分光光度法检测试剂盒 （Caspase-2 Colorimetric Assay Kit） Cat number：KGA For Research Use Only Store at -20 Expire date： 一、 试剂盒说明 Caspase家族在介导细胞凋亡过程中起着很关键作用。Caspase-2（Nedd2/ICH-1）是遗传毒性压力（genotoxic stress）诱导细胞凋亡信号路径中开启酶，可能对于caspase-9和caspase-3激活和凋亡下游事件诱导相关键意义。caspase-2表示和组织发育阶段相关，均表示于心脏、肾和脑。 Caspase-2分光光度法检测试剂盒是将caspase-2序列特异性多肽偶联至发色基团，当该底物被caspase-2剪切后，发色基团即游离出来，可经过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，可考察caspase-2活化程度。 本试剂盒适适用于培养细胞及新鲜组织caspase-2检测。 二、试剂盒组份 组 份 Cat: KGA206 （20 assays） Cat: KGA207 （50 assays） Cat: KGA208 （100 assays） 储存条件 Lysis Buffer 5.0 mL 10.0 mL 15.0 mL 4 2×Reaction Buffer 1.0 mL 2. 5 mL 5.0 mL 4 Caspase-2 Substrate 100μL 250μL 500μL -200 DTT 50 μL 100 μL 150 μL -20 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μL比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本） 1.5m L Microtube、PBS、蛋白定量试剂（可选购凯基Bradford法蛋白含量检测试剂盒或BCA蛋白浓度测定试剂盒）及仪器、 四、使用注意事项 1. Caspase-2 Substrate避光保留及使用。 对一些凋亡诱导剂引发细胞凋亡可能存在非依靠于Caspase-2活化机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-2活性无显著改变，需要考虑凋亡机制中其它信号通路。 细胞数量需达成3~5×106个或新鲜组织100mg，方便能达成测定需要100~200μg蛋白要求，因为Caspase-2活性和细胞裂解液蛋白含量相关，如测定OD值偏低，可经过增加细胞数量或组织量方法来提升蛋白量。 五、操作方法 （一）样品裂解 Ⅰ．细胞裂解方法 用合适方法诱导细胞凋亡，同时设置阴性对照组，并搜集细胞； 用PBS洗涤细胞二次（离心rpm，5min）搜集3~5×106个细胞，尽可能去除PBS上清； 在搜集沉淀细胞中加入50μL 冰凉Lysis Buffer（注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT），吹打均匀； 置冰上裂解20～60min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s；或冻融2～3次； 4oC，离心 (10,000 rpm) 1 min； 小心吸收上清（含裂解蛋白质）转移至新管中，并放置冰上待用； 7．取少许上清（1～2μL），常规方法（Braford法或BCA法）测定其中蛋白浓度； Ⅱ．组织裂解方法 1. 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右小块，加入50μL 冰凉Lysis Buffer（注意：使用前每50μL Lysis Buffer加入0.5μL DTT），玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作； 2．?取组织匀浆液转移到1.5mL预冷离心管， 10000转/分，4℃离心5 min； 3．小心吸收上清（含裂解蛋白质）转移至新管中，并放置冰上待用； 4．取少许上清（1～2μL），常规方法（Braford法或BCA法）测定其中蛋白浓度； （二）Caspase-2检测 1．吸收50μL含100~200μg蛋白细胞或组织裂解上清；如体积不足50μL用Lysis Buffer补足至总体积50μL（各组均采取一样蛋白量进行测定和比较）； 加入50μL2×Reaction Buffer（注意：使用前每50μL 2×Reaction Buffer加入0.5μL DTT）； 3．加入5μL Caspase-2 Substrate并于370 4．用酶标仪或分光光度计（100μL比色皿）在λ=405nm或400nm测定其吸光值。经过计算 OD诱导剂/OD阴性对照倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-2活化程度。 注意：以Lysis Buffer和Reaction Buffer作为空白对照。 （50μL Lysis Buffer + 50μL 2