荧光原位杂交实验(FISH) .pdfVIP

荧光原位杂交实验（FISH） 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学 技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构 变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 1 实验方法原理： 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学 技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构 变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单 链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着染 色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定 位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性 高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如 α 卫星、卫星 III 类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3） 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针， 杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素- 荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测 500bp 的片段。而直接标记法是将荧 光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷 三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间 接标记的方法。 2 实验材料、试剂、仪器耗材： 人的 MyoD1 （MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本 指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20 等 恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400 荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL 移液器、暗盒等 3 实验步骤： 一、实验材料准备 1. 实验用具及材料 2. 相关溶液的配制 （1）20×SSC ：175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠，加水至 1 000 mL （用10 mol/L NaOH 调 pH 至 7.0）。 （2）去离子甲酰胺（DF）：将 10 g 混合床离子交换树脂加入 100 mL 甲酰胺中。电磁搅 拌 30 min，用 Whatman l 号滤纸滤。 （3）体积分数 70%甲酰胺/2×SSC ：35 mL 甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL 水。 （4）体积分数 50%甲酰胺/2×SSC ：100 mL 甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL 水。 （5）体积分数 50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。 （6）杂交液：8 μL 体积分数 25%DS，20 μL 20×SSC 混合。（或 40 μL 体积分数 50% DS， 20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O 混合）取上述混合液 50 μL，与 5 μL DF 混合即成。其终 浓度为体积分数 10% DS，2×SSC，体积分数 50% DF。 （7）PI/antifade 溶液 PI 原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为 100 μg/mL，取出 1 mL，加 39 mL 双蒸水，使终 浓度为 2.5 μg/mL。Antifade 原液：以 PBS 缓冲液配制该溶液，使其浓度为 10 mg/mL， 用 0.5 mmol/L 的 NaHCO3 调 pH 值为 8.0。取上述溶液 1 mL，加 9 mL 甘油，混匀。 PI/antifade 溶液：PI 与 antifade 原液按体积比 1:9 比例充分混匀，－20℃保存备用。 （8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制 1mL/