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构建TRAP 系统解析LPS 引起的室旁核及垂体翻译组变化 目 录 摘 要iv Abstract vi 缩略语表ix 1 文献综述 1 1.1 脂多糖（LPS ）引发的全身系统性炎症 1 1.1.1 系统性炎症 1 1.1.2 LPS 诱导的细胞因子引发系统性炎症反应2 1.1.3 神经系统对系统性炎症的感知3 1.2 神经- 内分泌-免疫网络概述4 1.2.1 神经- 内分泌-免疫网络的结构和功能基础5 1.2.2 神经- 内分泌-免疫网络的调节6 1.2.3 神经- 内分泌-免疫网络与系统性炎症7 1.3 下丘脑-垂体系统7 1.3.1 下丘脑室旁核在维持机体稳态中的地位8 1.3.2 垂体在维持机体稳态中的地位9 1.4 翻译组学 11 1.4.1 核糖体分析技术（Ribo-seq ） 12 1.4.2 核糖体亲和纯化技术（TRAP-seq ） 13 1.5 局部翻译 （Local translation ） 17 1.6 现代生物学分析方法在研究中的应用 18 1.6.1 高通量测序技术的应用 18 1.6.2 转录组学分析技术的应用 19 2 目的与意义21 3 材料与方法22 3.1 实验材料22 i 华中农业大学 2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 3.1.1 质粒、菌株、细胞系和实验动物22 3.1.2 工具酶及主要试剂22 3.1.3 实验设备及耗材23 3.1.4 主要培养基及缓冲液配制24 3.1.5 相关软件28 3.2 实验方法28 3.2.1 质粒的构建28 3.2.2 重组质粒的鉴定与制备35 3.2.3 哺乳动物细胞系培养及细胞转染38 3.2.4 细胞水平验证Ribo-seq 39 3.2.5 细胞水平验证SMART 建库方法49 3.2.6 AAV 的包装和纯化浓缩57 3.2.7 小鼠脑部环路标记及鉴定60 3.2.8 TRAP 及文库构建62 4 结果与分析69 4.1 TRAP-RF 构建文库的细胞水平结果69 4.1.1 rAAV-TRAP 系统质粒的构建70 4.1.2 HEK-293T 细胞转染及RNA 提取结果71 4.1.3 RNA footprint 构建文库的细胞水平结果72 4. 1.4 减少初始细胞用量对文库质量影响的初步探索73 4.2 SMART 技术构建文库的细胞水平结果74 4.2.1 HEK-293T 细胞转染及RNA 提取结果75 4.2.2 全长RNA 构建文库的细胞水平结果76 4.3 定位至垂体的TRAP 系统的构建78 4.3.1 pAAV-mAPP-TRAP 系统质粒的构建78 4.3.2 重组腺相关病毒包装结果79 4.3.3 重组腺相关病毒颗粒的纯化浓缩及病毒滴度测定结果80 4.3.4 小鼠立体定位注射及鼠脑组织震荡切片荧光结果80 ii 构建TRAP 系统解析LPS 引起的室旁核及垂体翻译组变化 4.4 LPS 引起的小鼠PVN 和垂体的翻译组变化分析81 4.4.1 PVN 和垂体的组织分离及翻译组文库构建结果81 4.4.2 LPS 引起的PVN 及垂体转录组水平差异表达基因的分析83 4.4.3 LPS 引起PVN 及垂体在转录组和翻译组水平基因表达差异84 4.4.4 LPS 引起的PVN 中翻译组水平差异表达基因的分析85 4.4.5 LPS 引起的垂体中翻译组水平差异表达基因的分析87 5 结论与讨论89 5.1 初代rAAV-TRAP 系统的构建89 5.2 第二代rAAV-mAPP-TRAP 系统的构建90 5.3 LPS 引起的PVN 和垂体翻译组水平基因表达差异分析90 5.4 结论91 参考文献93 致谢 107 iii 华