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RNA 提取心得/经验/体会/纪律（RNA 提取注意事项）！ 纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要 彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。 纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得 率。 Rnase 污染的 10 大来源 1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另 外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处 是保护实验人员。 2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离 心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用 前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。 3：水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。 4：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。 5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好 办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却 是唯一的办法。 ;6：RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。 7：质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。 8：RNA 保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。 9：阳离子 (Ca, Mg) – 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切， 故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。 10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。 RNase 和 DEPC 处理 1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有 灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌 后 Rnase 仍然不能认为没有残留。 2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底 破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。 3：在 1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都 有效。 4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实 验是有影响的。我也来谈谈 RNA 的提取，我觉得 14 楼说的方法很严格，但是有 时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。而在有些步骤一定要小心了。以下的 内容，是讲给那些既想偷懒，有希望实验结果有保证的人听的，如果你是习惯于 每一步都很严格的人的话，建议还是按照 14 楼的方法做，因为那样才是正途啊。 好了，下面是给想偷懒，但又不想搞砸实验的战友看的。用最少的时间，Money， 力气，来做出最好的结果，是我们的终极目标（PS：我相信一句话，懒人推动科 技进步！个人愚见，大家不要拍我啊）。我是做植物的，所以以植物 RNA 提取为 例子： 一、关于器皿的处理： 枪头 ep 管最好是用 DEPC 处理一下，当然如果老板钱多的话，尽管用进口的 RNase-Free 的吧。这里，如果你想要偷点懒，也是有办法的，就是少处理一些 ep 管，因为后面我们会讲到，不是所有的 ep 管都一定要处理的。 研钵，这个东西按要求是要高温干燥处理的，但是在实际实验中，如果你不 处理的话，也不会有太大的影响。因为在一般我们要处理的材料上都会带有很多;3;4;5;6;7