LRRC8A在副猪嗜血杆菌CDT诱导NPTr细胞p53凋亡途径中作用的研究.pdfVIP

LRRC8A 在副猪嗜血杆菌CDT 诱导NPTr 细胞p53 凋亡途径中作用的研究 目录 摘要 i Abstract iii 缩略语表 v 1 文献综述 1 1.1 副猪嗜血杆菌的研究进展 1 1.1.1 副猪嗜血杆菌概述 1 1.1.2 副猪嗜血杆菌和宿主细胞的相互作用 1 1.2 细胞膨胀致死毒素的研究进展 2 1.2.1 细胞膨胀致死毒素的结构及各亚基的功能 2 1.2.2 细胞膨胀致死毒素的组装分泌与入胞转运 3 1.2.3 细胞膨胀致死毒素的细胞毒性 4 1.2.4 不同病原细胞膨胀致死毒素的研究进展 5 1.3 细胞凋亡的研究进展 6 1.3.1 细胞凋亡途径 6 1.3.2 p53 通路的研究进展 9 1.4 LRRC8A 的研究进展 10 1.4.1 LRRC8A 的结构 10 1.4.2 LRRC8A 功能的研究进展 11 2 研究目的与意义 14 3 材料与方法 15 3.1 试验材料 15 3.1.1 质粒、细胞和试剂 15 3.1.2 试剂配制 15 3.1.3 实验引物 16 3.1.4 实验仪器 19 3.2 实验方法 19 3.2.1 新生仔猪气管上皮细胞系NPTr 细胞培养 19 3.2.2 重组质粒的原核表达 19 3.2.3 蛋白的纯化 20 3.2.4 NPTr 细胞的转染 21 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 3.2.5 NPTr 细胞的流式 21 3.2.6 qRT-PCR 分析 22 3.2.7 Western Blot 分析及caspase 3 活性检测 23 4 结果与分析 25 4.1 原核表达及纯化细胞膨胀致死毒素的SDS和Western Blot 检测.. 25 4.2 细胞膨胀致死毒素诱导NPTr 细胞以p53 依赖的途径凋亡 26 4.3 体积调节阴离子通道阻断剂PPQ-102、NS3728 可降低CdtABC 诱导的 NPTr 细胞凋亡 28 4.4 瞬时敲低LRRC8A 可降低细胞膨胀致死毒素诱导NPTr 细胞的凋亡 31 4.5 稳定敲除LRRC8A 可降低细胞膨胀致死毒素诱导的NPTr 细胞凋亡 33 5 讨论 39 6 结论 42 参考文献 44 附录 58 致谢 60 II LRRC8A 在副猪嗜血杆菌CDT 诱导NPTr 细胞p53 凋亡途径中作用的研究 摘要 细胞膨胀致死毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)是副猪嗜血杆菌重要毒力因 子，但其致病机理尚不清楚。为揭示副猪嗜血杆菌CDT 对猪上皮细胞损伤的机制， 本研究以新生仔猪气管上皮细胞(Newborn piglet tracheal cell, NPTr)为模型，通过蛋 白质表达及纯化、流式细胞术、qRT-PCR 、Western Blot、CRISPR/Cas9 等方法探究 了LRRC8A 在副猪嗜血杆菌 CDT 诱导NPTr 细胞凋亡中的作用，主要研究内容如 下： 1. 成功表达并纯化了副猪嗜血杆菌 CdtA、CdtB 、CdtC，并将其与NPTr 细胞 进行相互作用，结果显示：CdtABC 可以诱导NPTr 细胞发生凋亡，且呈现显著的剂 量依赖性(P0.001) ，同时p53 通路中p53 、p-p53 及促凋亡因子BAX 表达显著上调 (P0.01) ，抑凋亡因子Bcl-2 显著下调(P0.001 ），凋亡执行者cas