PPARα调控TRF及其对铁过载诱发铁死亡的影响机制.pdfVIP

PPARα 调控TRF 及其对铁过载诱发铁死亡的影响机制 目录 摘要i Abstract iii 缩略语表（Abbreviation ）v 1 前言 1 1.1 铁死亡的研究进展 1 1.1.1 铁死亡的概述 1 1.1.2 铁死亡的发生机制 2 1.1.3 铁代谢在铁死亡中的作用 5 1.1.4 铁死亡诱导剂与抑制剂 6 1.1.5 铁死亡在相关疾病发生和发展中的作用 7 1.2 PPARα 的概述 8 1.2.1 PPARα 的结构与功能 8 1.2.2 PPARα 的配体 9 2 研究目的与意义 10 3 材料和方法 11 3.1 实验材料 11 3.1.1 细胞和菌株 11 3.1.2 载体 11 3.1.3 小鼠 13 3.1.4 主要试剂和试剂盒 13 3.1.5 主要仪器和设备 14 3.1.6 应用的分析软件和生物信息学网站 15 3.2 实验方法 16 3.2.1 载体构建 16 3.2.2 细胞培养 20 3.2.3 细胞转染 21 3.2.4 构建TRF 启动子荧光素酶报告载体 21 3.2.5 双荧光素酶报告基因检测 22 3.2.6 实验动物及饲养管理 23 3.2.7 RNA 提取、cDNA 制备 24 3.2.8 荧光定量PCR 分析 25 3.2.9 总蛋白提取 26 3.2.10 蛋白浓度测定 27 I 华中农业大学2020 届硕士学位论文 3.2.11 Western blot 分析 27 3.2.12 血清丙氨酸转氨酶（ALT/GPT ） 28 3.2.13 血清天冬氨酸转氨酶（AST/GOT ） 29 3.2.14 组织铁含量检测 30 3.2.15 组织MDA 含量检测 31 3.2.16 ELISA 检测肝脏组织和血清TRF 含量 31 3.2.17 冰冻切片组织ROS 含量检测 32 3.2.18 HE 染色样品处理 33 3.2.19 统计分析 33 4 结果与分析34 4.1 PPARα 通过结合TRF 启动子抑制TRF 的表达34 4. 1.1 体外和体内激活PPARα 抑制TRF 表达 34 4.1.2 PPARα 通过PPRE 与TRF 直接结合，调控TRF 表达 36 4.2 体内激活PPARα 或Fer-1 均缓解了铁过载诱发的肝脏铁死亡损伤37 4.2.1 铁过载模型中，TRF 表达显著降低；激活PPARα ，TRF 表达进一步降低 37 4.2.2 Fer-1 有效缓解铁过载诱发的PPARα-/-小鼠肝脏铁死亡损伤 38 4.2.3 WT 小鼠中激活PPARα 或Fer-1 均缓解了铁过载诱发的肝脏铁死亡损伤. 40 4.3 超表达GPX4 缓解铁过载PPARα-/-小鼠肝脏铁死亡损伤42 4.3.1 构建鼠源GPX4 真核表达载体 42 4.3.2 GPX4 在细胞水平超表达 43 4.3.3 超表达GPX4 缓解铁过载诱发的PPARα-/-小鼠肝脏铁死亡损伤 44 5 讨论48 6 结论 50 参考文献 51 致谢 60 II PPARα 调控TRF 及其对铁过载诱发铁死亡的影响机制 摘要 铁死亡是一种新的调控细胞死亡的方式，是脂质过氧化铁依赖性累积的结果。 铁死亡在形态，生化和遗传上均不同于其他形式的细胞死亡，包括细胞凋亡，细胞 坏死以及自噬。细胞发生铁死亡的关键因素是二价铁（Fe2+ ）的积累和脂质过氧化， 而铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂等可以抑制该过程。过氧化物酶增殖物激活受体 α （Peroxisome proliferators-activated receptor α, PPARα ）