重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检验方法的建立.doc

重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法建立 首席医学网 ???? 05月25日 【关键词】磺胺嘧啶银 摘要:目标和方法 经过探讨用MTT法检测重组人表皮生长因子（rhEGF）复方抗菌凝胶生物活性试验参数，包含凝胶剂中卡波姆含量对测定屏蔽作用、不一样试剂对卡波姆组分屏蔽作用解除、抗菌成份磺胺嘧啶银浓度和EGF含量对复方凝胶检测方法影响作用等，建立一套适适用于EGF复方抗菌凝胶剂生物活性检测方法。结果 优选出最好条件：EGF质量分数为20 μg/g，卡波姆质量分数为1.0%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶分数浓度为0.5%~2.0%。结论? 本文方法可快速正确地对EGF复方凝胶活性进行检测,从而为复方凝胶剂开发提供条件。 关键词:重组人表皮生长因子;磺胺嘧啶银; 复方 ;凝胶剂 MTT法 表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可显著促进创面愈合 ，尤其对部分难愈合创面作用更佳，含有很高临床价值［1-6］。现在临床上关键使用基因工程生产重组人表皮生长因子（recombinant human EGF, rhEGF）凝胶剂［7］。古巴rhEGF凝胶和磺胺嘧啶银复方制剂已经上市，中国也有数家单位正处于研发阶段［8,9］。在开发rhEGF复方抗菌凝胶过程中，最大困难在于rhEGF复方抗菌凝胶生物活性检测问题。本文经过改良MTT［10］结合酶联仪检测方法，对rhEGF复方抗菌凝胶多个组分浓度进行分析，拟建立了一套简便有效检测方法。 　1? 材料和方法 细胞株 　Balb/c3T3，由中国药品生物制品检定所提供。 1．2? 培养基 RMIP 1640，购自GIBCO企业； 1．3? 试剂 四甲基偶氮唑盐(MTT), 购自JANSSEN HIMICA企业；小牛血清(calf serum ，CS)，购自Hyclone企业；EDTA、NaCl、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、尿素、甘氨酸（上海生工企业），分析纯。 1．4? 仪器 振荡器，购自德国IKA企业；酶标仪， BIOTEK企业。 1．5? 样品 EGF国家标准品：由中国药品生物制品检定所提供，－20 ℃保留。 rhEGF复方凝胶样品［9］：自制，关键成份为rhEGF、磺胺嘧啶银、卡波姆，经过设定不一样质量分数卡波姆组分，测定其活性最好配方。 对照品：rhEGF水溶液，由桂林华诺威企业提供，用超纯水稀释成ρ=1 mg/mLEGF溶液，待用。 细胞培养 将保留在液氮Balb/c3T3细胞用含ρ=20％CSRMIP 1640复苏培养再活化，然后用含ρ=10％CSRMIP 1640培养基培养，传代1次，待铺展率达成70％~80％后用于检测。 1．7? rhEGF复方抗菌凝胶优化 Balb/c3T3细胞增殖MTT检测法? 正确称取rhEGF复方抗菌凝胶 1.0 g，加入200? mL含ρ=0.4% CSRMIP 1640培养基中，在混合器上振荡1 min，然后用0.22? μm滤膜过滤，得到澄清滤液。以此滤液作为第一个稀释度（40），然后继续进行4倍稀释，至4-5，将各个稀释度样品加在已接种Balb3T3细胞96孔板中，培养72 h，用MTT法于490 nm波优点检测活性。标准品第一个稀释度（40）为50 IU/mL，一样4倍稀释至4-5。用相同浓度水剂做对照；含ρ=10% CS RMIP1640培养基做阳性对照；含ρ=0.4% CS RMIP 1640培养基做阴性对照。 1．8? 卡波姆干扰作用屏蔽剂加入 将不一样试剂分别和样品作用，旋涡10 min震荡分散，再加入甘氨酸，混匀，过滤，取滤液。 1．9? 评定公式 样品效价（IU/mg）= 50IU×200× 标准品半效价量稀释度???? 样品相当于标准品半效价量稀释度 ――50IU为标准品第一个稀释度活性； ――200为样品预稀释度 结果和讨论 rhEGF凝胶中卡波姆组分对表皮生长因子生物活性测定影响 　以卡波姆为变量，分别配制多个不一样质量分数卡波姆EGF（20 μg/g）凝胶。凝胶外观为水溶性无色透明、质地均匀凝胶制剂。伴随卡波姆浓度提升，凝胶剂黏度对应提升。 样品处理参考“1.7”。依据对不一样浓度卡波姆凝胶剂生物活性测定，发觉卡波姆成份在测定中，对细胞生长含有一定抑制作用。伴随卡波姆浓度提升，其测出生物活性和同浓度水剂对照品含有较大差异，见图1。结果表明，ω=0.5%、1.0%卡波姆对EGF生物活性无显著影响，ω=2%、3%卡波姆对EGF生物活性影响较大，综合考虑凝胶剂铺展性和黏度，优选了卡波姆终质量分数为1.0%凝胶作为备选浓度。 不一样试剂对EGF复方抗菌凝胶屏蔽作用解除 配制磺胺嘧啶银质量分数1.0%、EGF 20 μg/g凝胶，用纯水+甘氨酸、EDTA+甘氨酸、PBS+甘氨酸、