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第二章(6)植物体细胞杂交技术 课 题 植物体细胞杂交技术 课 程 1 了解植物体细胞杂交的意义 教 学 2 掌握植物体细胞杂交的过程 3 掌握PEG融合处理 目 标 教学重点 植物体细胞杂交的过程 教学难点 PEG融合处理 课 型 课堂讲授 授课时数 3 使用教具 多媒体 .、八 、- 刖言 有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段， 它的作用空间主要限于种内的品种之间。 种 及种以上分类单位之间的杂交， 例如种间或属间杂交， 则常常遭遇有性不亲和性障碍。 在无 性繁殖植物和性不育植物中，如在马铃薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是难以通过有性 杂交进行遗传改良。 因此，建立在原生质体全能性基础上的体细胞杂交和胞质杂交技术，对于植物的遗传 改良具有重要的意义。 1 体细胞杂交(somatic hybridization) 在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植株 的过程。 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞 杂种。 2体细胞杂交步骤 原生质体的制备 原生质体的融合 自发融合 在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体 （homokaryon） ，每 个同核体包含2?40个核。 形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。 减少自发融合的措施： 在用酶液处理之前， 使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用， 切 断胞间连丝。 诱发融合 NaNO3 处理 1909 年， Kuster 在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗 NaNO3 溶液可以引起 2 个亚原生质体的融合。缺点：异核体 （heterokaryon） 形成频率不高。 高 PH- 高浓度钙离子处理 1973年，Keller和Melchers ,用强碱性（PH10.5）的高浓度钙离子 （50mmol丄-1）溶液在 37C下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。 但对于有些原生质体系统， 这样高的 PH 值是有毒的。 PEG （聚乙二醇）处理 PEG 的作用机理： Kao 等认为，由于 PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正 极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H 键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结 果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。 另外， PEG 能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 PEG 作为融合剂的优点 : 异核体形成的频率高，可重复性强，对大多数细胞低毒； 形成双核异核体的频率高。 据Burgess和Flenming （1974年）报道：在37C下用高钙离子的强碱性溶液处理时， 产生的聚集体 很大，每个包含很大原生质体。以 PEG 为融合剂时，多数聚集体包含 2?3 个原生质体。 图1融合基本过程 细胞A 细胞B 用月兑糜醸处理除去细胞壁 原生顏体A 更丰质体B 混合 加入约403■的聚 乙二醇 1 P 原生质体笈生融?合 涂在能使细胞壁再生的培养基上 挂出詢落 彩印到选择性培养基上 1P 检出車组合子的制落 注意事项： PEG的分子量 （MW 1500?6000） 酶溶液浓度 原生质体来源 PEG的稀释逐步进行 在PEG溶液中，加入钙离子可以提高融合效率） 高温（35?37C） 4%?5% （V/V ）的原生质体悬浮液 所用酶种类和浓度，一般用崩溃酶。 材料预培养 融合地点（在离心管中，在小液滴中） （11）在PEG溶液中的保温时间太长会降低异核体形成频率。 2.224电融合 将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融合小室中，小室两端有电极，在不均匀的交 变电场的作用下，原生质体彼此靠近，在两个电极间排列成串珠状。这时， 如果有足够强度 的电脉冲，就可以使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 2.2.3融合产物的细胞学 在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。 过程中，二者的染色体被一个共同的纺锤体所牵引，在有丝分裂末期形成两个杂种子细胞。 最终分化出体细胞杂种，其核内具有双亲的染色体组。 在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中， 两个来源不同的染色体组常常不能完全结合在一 起。在动物体细胞杂种细胞系中， 已知双亲之一的染色体会逐渐消除， 在植物中也看到这种 现象。 杂种细胞选择 根据物理特性选择 根据可见标志选择 主要用于非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合。 根据荧光标记选择 将 2 种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，然后通过荧光显微镜鉴别异核体。 低密度植板选择 突变互补选择 隐性突变互补选择 显性抗性互补选择 隐性突变与野生型互补选择 显 -隐性双突变体选择 2.3.3 根据生长和再生能力的差别选择 根据愈伤组织生长差别选择 在曼陀罗和烟草种间体