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实验七 DNA体外重组技术
一?概念
DNA重组:指不同来源的 DNA片段共价连接,通过重新组合,构成了具有两个 DNA
分子遗传信息的新的重组体 DNA。
DNA体外重组技术:是在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基 因,在体外与载体 DNA分子重组,然后将重组子转入受体细胞,并筛选出表达重组 DNA
的活细胞,加以纯化、扩增、成为克隆,这一过程称为 DNA体外重组技术。DNA体外重
组技术是基因工程的核心内容。
二.基本过程
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分、切、连、转、筛
1?分:分离出要克隆的目的基因及载体。
目的基因的来源:
i。 直接分离
适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒 DNA的提取分离。首先通过组建几
种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位,然后用 DNA的酶切片段电泳分离 DNA,应用
相应DNA探针确定目的DNA后,从胶中回收 DNA。
ii。 人工合成
序列明确的短DNA片段,可用DNA合成仪合成。
iii。 由 mRNA逆转录合成 cDNA
细胞总RNA分离 mRNA分离 目的基因mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA发卡环的消化 cDNA的克隆
iv。 从基因组文库中筛选目的基因
首先构建基因组文库(G文库)或cDNA文库(C文库),需要时利用探针技术将所需目的 基因“钓”出来。
v。 PCR
载体:可容忍外源性 DNA片段插入,可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的 DNA分
子。
理想的质粒克隆载体应具有的特性:
i ?能在宿主细胞中独立复制,并能携带 DNA片段一同扩增
i ?具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点 ,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites),
便于进行克隆
分子量小,可插入较大的外源 DNA而不影响复制
V ?易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 a -互补显色反应(蓝白
斑筛选)
v .表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子,前导序列,增强子等调控元件
vi。 生物安全性好
目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。
2?切:用限制性内切酶切割目的基因和载体,使其产生便于连接的末端。
3?连:将切割后的目的基因和载体用 T4DNA连接酶连接。
4?转:把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程(细菌: E.coli,真菌:Yeast,昆虫细
胞或哺乳动物细胞)。
5?筛:在不同层次上、不同水平上进行筛选,鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法,将 带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如:载体大小,酶切结果,筛选标记等。 实验质粒DNA提取
一?原理
1定义
独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。 是一种环状的双链 DNA分子。
可赋予宿主细胞一定生物学性状,如:抗生素抗性 Ampr等。
来源
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。
3?分类
质粒按复制方式分为两种类型:松弛型质粒和严紧型质粒
严紧型质粒(Stringent control)
严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制 ,当染色体不复制时,它也不能复制,通常
每个细胞内只含有 1个或几个质粒,如F因子。
松弛型质粒(Relaxed control)
松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制 ,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以
上,如Col质粒。
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白,完全依赖于宿主提供的半衰期较长的 酶。即使蛋白质合成受抑制, 质粒的复制依然进行。 当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复
制的氯霉素等抗生素存在时,质粒的拷贝数可达 2000-3000拷贝。
4.构型
质粒构型:超螺旋型(SC),开环形(0C),线型(LC)
加样孔 皈
□ H □
oc SC
5?碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒 DNA的原理是根据共价闭合环状质粒 DNA与线性染色体DNA的分
子大小和结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时,线性DNA被彻底变性,但共价闭环质粒 DNA虽然H键也发生断裂, 但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入 pH4.8的KAC时,溶液恢复中性,质粒 DNA迅速复性,染色体 DNA则由于变性而相互混乱缠绕,不能复性,从而离心即可以把变性的染色体 DNA沉淀
和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
质粒DNA
染色体DNA
分子量
小(1.5kb — 15kb 或 60kb — 120kb)
大
结构
超螺旋,共价,闭环
线性,双螺旋
变性 pH 12.6
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