糖代谢相关酶的活性测定方法.docx

崔娜 蔗糖代谢有关酶的活性测定： 在果实生长发育的不同时期：花后 20、30、40、50天取鲜样，快速取果实的不同部 位，称重约1g，分成若干份，液氮速冻后保存在-50 C冰柜中。以备以后酶的测定。 1、 取1g冻的组织在研钵中研磨加少量的石英砂和 10mlHEPES缓冲液（50mMHEPES-NaOH, PH7.5, 1mM EDTA, 10mM MgG|2.5mMDTT,10mM勺维生素 C 和 5%勺不溶性的 PVPP 冰 浴研磨成匀浆，四层纱布过滤，12000X g（4 C ）离心20分钟（或30000X g,2 C，离心 10分钟），弃沉淀。 2、 上清液逐渐加硫酸铵至80%§解度（每管加6克），放置15分钟，再12000X g（4 C ）离 心30分钟。 3、 弃上清液，用提取缓冲液3ml溶解沉淀，灌进透析袋。再用稀释10倍的提取缓冲液（不 含PVPP透析20小时。 4、 相关酶活性的测定；细胞壁结合转化酶的提取参照Islam等，以上所用操作均在0-4 °C 进行。按Islam等的方法测定蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶的活性，以卩 mol Sucrose.h-1.g-1FW表示酶的活性，按 Merlo和Passera的方法测定可溶性酸性转化酶、 中性转化酶，以卩mol Glucose.h -1.g -1FW表示相关酶的活性。所有测定均重复 3次。 5、 酸性转化酶和中性转化酶的测定，最后体积为 1ml。酸性转化酶包含 PH4.8的 0.1MNaHPO0.1M柠檬酸缓冲液0.6ml, 0.1M的蔗糖0.2ml和0.2ml酶提取液。中性转 化酶包含 0.1MK2HPO0.1M 柠檬酸钠（PH为 7.2 ） 0.6ml，0.1M 的蔗糖 0.2ml 和 0.2ml 酶提取液，在37C孵育30分钟，向反应液中加入1ml蒸馏水，再加1.5ml二硝基水杨 酸试剂停止反应，沸水浴5分钟，流水冲洗冷却，向每管中加入21.5ml蒸馏水，在520nm 比色。 葡萄糖标准曲线的制作： 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试齐U( ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 沸水浴5分钟，立即用自来水冷却 蒸馏水(ml) OD520nm 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 SPS和SS的活性测定，根据Huber和Israel的方法，稍加改变。 蔗糖合成酶（SS的测定：取0.1ml的0.05M果糖，O.lmlUDPG 0.1ml的O.IMTris、 0.05ml 的 10mMMgC和 0.2ml 酶液。 蔗糖磷酸合成酶（SPS的测定：取 0.1ml的F6P, 0.1mlUDPG 0.1ml的0.1MTris、 0.05ml 的 10mMMgC和 0.2ml 酶液。 将上述反应液在 37C下保温30分钟后，在100C水浴1分钟，定容至1ml,加 0.1ml2NNaOH放入沸水浴中10分钟，经流水冲洗，加 3.5ml30%HCl和1ml0.1%间苯二酚, 摇匀，放入80C水浴10分钟，经流水冷却，在480nm处比色。 另取20?200 ^g蔗糖，加水至1ml,再加2N的NaOH0.1mJ其他步骤与上述测定样品的 方法同，以不同浓度的蔗糖测得的结果，绘制蔗糖的标准曲线以计算酶反应中蔗糖形成的 数量，蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶的活力均以 mg蔗糖.鲜重（g） -1.小时-1表示。 具体标准曲线配制方法如下： 先配制200⑥/ml的蔗糖溶液，然后，取7只试管（0、1、2、3、4、5、6） 0 1 2 3 4 5 6 蔗糖标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 加蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 浓度4 0 20.00 40.00 80.00 120.00 160.00 200.00 Hepes缓冲液的配制：90ml蒸馏水溶 1.6 克的 NaCl,0.074g 的 KCI,0.027gNa2HPQ2H2O,0.2g 的葡聚糖，1gHepes,用 0.5M NaOH调 PH至 7.5,最后定容至 100ml。