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第十七章 补体参与的反应及补体测定 郑州大学医学检验系 秦东春 dchqin@ 补体（complement,C）是存在于正常人及脊椎动物血清中的一组与免疫相关并可被激活的蛋白质。 它包括近40种可溶性蛋白和膜结合蛋白，所以又称为补体系统（Complement system）。 在正常生理情况下，多数补体成分以非活化形式存在，补体主要的激活途径有： 经典激活途径(claasical complement pathway) 旁路激活途径(alterlative complement pathway) 在激活过程中可产生多种生物活性物质，引起机体的一系列生物学效应。 第一节　补体参与的反应 一、免疫溶血试验 二、补体结合试验 三、补体依赖的细胞毒试验 四、免疫粘附试验 一、免疫溶血试验 免疫溶血试验的原理是补体能使已被抗体致敏了的红细胞发生溶血。实验时将三者混合，置37℃30min，如条件适合溶血即可发生。 （一）参与免疫溶血反应的试剂 1、补体 2、绵羊红细胞 3、溶血素 1、补体 实验室多采用新鲜混合豚鼠血清作为补体的来源。 补体在体外极易失活，因此采血后需及时分离血清，及时使用，最好在当天用完，必须保存时需小量分装，置－20℃可保存数月（避免反复冻融），如为冻干制品可保存数年，但其活性都会有所降低。 使用前需滴定其效价。 2、绵羊红细胞 在免疫溶血反应中所用的抗原为绵羊红细胞（SRBC）。 可用Alsever液（主要成分为枸橼酸钠、枸橼酸和葡萄糖）保存于4℃三周。 用前以生理盐水洗涤三次，配成试验中所用的2%~5%的悬液。配制好后在542nm波长比浊，读取吸光度，按该吸光度值调节每次试验所用的红细胞浓度，使之保持一致。 3、溶血素 即抗绵羊红细胞抗体，多数是兔抗绵羊红细胞血清。 一般没有必要用纯化抗体，试验前需经56℃、30min灭活补体。 由于免疫溶血试验的结果与所用溶血素的多少有关，因此在试验前必需用免疫溶血试验滴定溶血素效价。 免疫溶血试验滴定溶血素效价操作如下 （1）稀释缓冲盐溶液 磷酸缓冲盐溶液或巴比妥缓冲盐溶液均可用于免疫溶血试验，pH值的范围在7.2~7.4之间，适量的氯化钠使溶液达到等渗。为保证补体的活化，在缓冲盐溶液中还需加入适量的钙离子和镁离子。 （2）溶血素的稀释 溶血素的效价一般都比较高，因此稀释时需注意稀释倍数，防止单位跨度太大，不利于效价的确定。可采用交叉等倍稀释法，即两三个等倍稀释系列交叉进行。 （3）溶血素的效价滴定 将不同稀释度的溶血素和等量的补体及绵羊红细胞混合于试管中，37℃水浴30min后观察。完全溶血的试管中液体红色透明，离心后无细胞沉降。完全不溶血的试管中液体浑浊，离心后红细胞完全沉降，上清液无色透明。不完全溶血的情况介于二者之间。 按以上标准，以产生完全溶血的溶血素的最高稀释度作为溶血素的效价，确定为一个单位（unit）。在试验中一般采用２个单位的溶血素，如：溶血素的效价为1：3000，配制２个单位的溶血素需将溶血素作1：1500稀释。 （二）免疫溶血试验的用途 1.溶血空斑试验是用已知SRBC和补体检测SRBC免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体； 2.CH50试验是用已知SRBC和溶血素检测血清总补体溶血活性。 3.补体结合试验是以溶血试验作指示，即用已知SRBC和溶血素检测补体是否被消耗，从而判定抗原抗体的对应情况。 4.抗补体试验也是以溶血试验作指示，检测血清中有无能结合补体的免疫复合物。 二、补体结合试验 原理 技术要点 方法评价 （一）?? 原理 补体结合试验（complement fixation test, CFT）是利用抗原抗体复合物可结合补体，而游离的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血素和绵羊红细胞这一对抗原抗体系统作为指示系统，用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）的试验。 在试验中有三个系统参与反应 ①指示系统——即溶血素及绵羊红细胞，试验时常将其预先结合，形成致敏绵羊红细胞（sensitized sheep RBC，SSRBC）； ②补体 ③反应系统——即已知的抗原（抗体）和待测的抗体（抗原）。 （二）?? 技术要点 SRBC浓度固定在1%~2%。 其他成分如溶血素，补体，抗原及抗体等均需事先滴定其单位，配制成特定的浓度，以保证结果的可靠性。 在补体结合试验中，待检血清使用前应预先灭活补体。 试验用2U溶血素。 1、抗原和抗体的滴定 抗原的效价为1：64，抗体的效价为1：32，以此稀释度为1u。 正式进行补体结合试验时，所用的抗原量为2u~4u，抗体量为4ｕ，在本例中抗原采用1：16~1：32稀释度，抗体采用1：8稀释度。 2、补体滴定　 补体结合试验前需滴定补体效价。按表17