TCA 蛋白沉淀方法.pptxVIP

100％（w/v）三氯乙酸的配制方法： 500g 三氯乙酸用 227ml 水来溶解，所得溶液即 100％三氯乙酸溶液。避光，4 度保存。 (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves!!!). 培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以 TCA 沉淀浓缩后跑电泳，一 般表达量大于 1mg/ml 可以看到明显条带，这是我用的 TCA 沉淀方法，效果很好： 1.菌液 10000g,离心 5 分钟，收集表达上清。 取 500-1000ul 上清于EP 管中，加入 1/9 体积的 100％TCA，颠倒 10 次混匀。 样品置于冰浴中大于 0.5 小时，过夜效果更好。 4.15000g,离心 10－20 分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将 EP 管倒扣在吸水 纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。 5.将 EP 管倒置于吸水纸长，37 度烘箱 10－20 分钟，待管底无明显液体残留，如 果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去 管底和管壁残余液体。 6.15000g,离心 10－20 分钟,用 20ul 枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快， 不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几 ul 或者没有，注意不要吸到 沉淀。 EP 管倒置于吸水纸长，37 度烘箱 5 分钟，确认管壁和管底没有液体残留。 加入 20－50ul Loading buffer，95 度加热 10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不 溶，用手指轻弹管壁或用 20ul 枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁， 因为管壁可能沾有残余 TCA。如果蓝色的 Loading buffer 不变成黄色，说明残余 TCA 吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了， 而且不影响电泳效果。 或者第 5 步和第 6 步改为丙酮洗: 5.加入 200ul 冰冷的丙酮，用手指轻弹 EP 管，洗去管底和管壁残余的TCA。 6.15000g,离心 10－20 分钟,倒掉上清，将 EP 管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除 去残余在管口的液体。 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). Vortex and let sit for 30min at 4oC. Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves!!!). Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes]. Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl;pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To elimina