葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因的克隆、表达及功能分析.pdfVIP

摘 要 摘 要 葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) （半翅目：根瘤蚜科）是一种世界性 分布的单食性害虫，只危害葡萄属植物，也是我国重要的植物检疫性有害生物之一， 可对葡萄造成毁灭性危害。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs ）是好氧生物中一类重要的多 功能酶，主要参与内源性和外源性化合物的解毒，还参与细胞内转运、激素生物合 成和抗氧化应激保护。深入研究葡萄根瘤蚜体内GSTs 基因的功能对于干扰其解毒 过程的害虫治理手段具有深远意义。本文以葡萄根瘤蚜为研究对象，对其谷胱甘肽 S-转移酶进行基因克隆获得了7 个胞质型DviGSTs ，并在此基础上进行了原核表达、 蛋白纯化、重组蛋白的酶动力学参数测定、抗氧化能力检测以及农药对重组蛋白的 离体抑制测定，主要研究结果如下： 1、基因克隆：克隆获得了7 个胞质型DviGSTs ，分别为DviGSTd1 、DviGSTd2 、 DviGSTt1 、DviGSTo1 、DviGSTs1 、DviGSTs2 和DviGSTs3 ，分属于四个不同的家族， 即Delta 、Theta 、Omega 和Sigma，经测序验证各基因的序列与NCBI 中序列一致。 7 个GSTs 基因开放阅读框长度范围为606-717 bp ，编码201-238 个氨基酸，分子质 量为58.73-70.22 KD，理论等电点范围为5.15-5.23 。 2 、原核表达及蛋白纯化：通过构建原核表达系统得到 pET28a(+)-DviGSTs 重 组表达质粒，后转入Rosetta gami 2 (DE3) 感受态细胞中成功构建表达菌。经IPTG 诱导表达及Ni 柱纯化，最终获得了7 个25-40 kD 大小的可溶性目的蛋白。 3、DviGSTs 的酶学特性分析：DviGSTs1 的米氏常数Km 最小，DviGSTt1 的米 氏常数 Km 最大；通过不同家族之间的对比发现，Delta 家族中的 DviGSTd1 和 DviGSTd2 均表现出较强的活性，Vmax 值最低的为DviGSTo1 。 4 、DviGSTs 的抗氧化性分析：检测7 个DviGSTs 的抗氧化活性仅发现Sigma 家族中 DviGSTs2 和 DviGSTs3 具有抗氧化性，且 DviGSTs3 的抗氧化性高于 DviGSTs2 。 5、DviGSTs 的离体抑制分析：测定GSTs 结构专性抑制剂及杀虫剂啶虫脒和氟 虫腈对重组蛋白DviGSTs 的活性抑制率。发现7 个DviGSTs 中仅有DviGSTd1 、 DviGSTd2 、DviGSTs1 的活性表现出能被药剂抑制。且杀虫剂啶虫脒和氟虫腈虽然 对DviGSTd1 、DviGSTd2 、DviGSTs1 表现出一定的抑制活性，但效果远不及GSTs 结构专性抑制剂。 本研究有助于了解GSTs 保护细胞免受氧化损伤的过程以及解析GSTs 对杀虫 剂的解毒代谢过程，为研究葡萄根瘤蚜的抗药性提供了理论基础，更为开发干扰解 I 西北农林科技大学硕士学位论文 毒过程的新型化合物从而对葡萄根瘤蚜进行化学防治策略提供了新的思路。 关键词：葡萄根瘤蚜；谷胱甘肽S-转移酶；原核表达 II 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 葡萄根瘤蚜的研究概况 1 1.1.1 葡萄根瘤蚜 1 1.1.2 葡萄根瘤蚜研究现状 1 1.2 昆虫抗性机理的研究 2 1.2.1 细胞色素P450s 3 1.2.2 酯酶介导的抗性 3