小麦条锈菌效应蛋白Pst14872靶标的鉴定及功能分析.pdfVIP

摘要 摘要 小麦作为我国一种重要粮食作物，种植范围广泛，其生产安全也直接关乎我 国的国计民生。小麦条锈病是小麦上常见病害之一，它是由条形柄锈菌小麦专化 型 (Puccinia striiformis f. sp. tritici) 引起的，严重危害小麦的生产。目前，主要通 过培育抗病品种和使用化学药剂来防治条锈病，但由于条锈菌毒性变异频繁且变 异方式多样，易导致已有的抗病品种抗病性减弱甚至丧失，使防治难度加大。有 研究表明，小麦条锈菌在侵染过程中会通过吸器分泌一些致病因子——效应蛋白， 来调控寄主的抗病反应。因此，为了加深人们对小麦条锈菌致病机制的理解，同 时指导人们对小麦条锈病的防控防治，对这些致病因子的研究具有一定的理论意 义。 在前期研究中，我们筛选到一个小麦条锈菌的效应蛋白Pst14872 。以此为基 础，利用酵母筛库技术筛选获得几个候选靶标，并利用酵母双杂交、Pull-down 和Co-IP 试验证实Pst14872 的互作靶标为TaClpS1 。 为明确靶标TaClpS1 的功能，我们做了进一步的试验。TaClpS1 基因序列分 析表明，TaClpS1 基因编码 162 个氨基酸，并包含一个进化保守的结构域ClpS 。 TaClpS1 特异定位于小麦原生质体的叶绿体中。qRT-PCR 实验发现靶标TaClpS1 受条锈菌侵染诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术 (VIGS) 沉默掉 TaClpS1 后，导致小麦对条锈菌的抗性增强，接菌24 h 时叶片中的活性氧面积显 著增加，病程相关蛋白基因TaPR1 和 TaPR2 的表达量明显增加。另外，组织学 观察发现接菌24 h 时吸器数及菌丝分支长度和120 h 的菌丝面积有所减少。 综上结果说明，小麦条锈菌效应蛋白Pst14872 与靶标TaClpS1 互作，并且 TaClpS1 负向调控小麦抗条锈病的防卫反应。 关键词：小麦；小麦条锈病；Pst14872；TaClpS1 I 目录 目录 摘要 I ABSTRACT II 第一章 文献综述 1 1.1 小麦条锈病概况 1 1.1.1 小麦条锈病的危害 1 1.1.2 小麦条锈菌的生活史 1 1.1.3 小麦与条锈菌的互作机制2 1.2 蛋白质水解过程3 1.3 Clp 蛋白酶的研究进展4 1.3.1 ClpP 蛋白4 1.3.2 AAA +分子伴侣5 1.3.3 ClpS1 衔接蛋白6 1.4 ClpS1 在植物生长过程中的作用7 1.5 本研究的目的意义及研究内容7 1.5.1 目的意义7 1.5.2 研究内容7 小麦条锈菌效应蛋白Pst14872 靶标的筛选及互作验证7 小麦条锈菌效应蛋白Pst14872 靶标的基因功能的分析7 技术路线8 第二章 小麦条锈菌效应蛋白Pst14872 靶标的筛选及验证9 2.1 引言9 2.2 试验材料9 2.2.1 试验材料9 2.2.2 试验主要试剂9 2.2.3 试验主要仪器9 2.3 试验方法 10 2.3.1 Pst14872 基因克隆 10 设计引物 10 Pst14872 基因扩增 10 PCR 产物回收 10 构建表达载体 11 大肠杆菌超级感受态