猴源MYH9羧基端蛋白阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的研究.pdfVIP

摘要 摘要 猪繁殖与呼吸综合征（Prorcine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS ）是 20 世纪80 年代后期出现的一种广泛传播的猪繁殖与呼吸系统疾病。猪繁殖与呼吸综 合征病毒（PRRSV ）是一种具有包膜，单股正链RNA 病毒。直径约为50-60nm 的球 形或椭圆形颗粒，外观相对光滑。PRRSV 在全球爆发三十余年，每年都给养猪业带 来巨大的经济损失，因此对PRRSV 的致病机理和高效疫苗的研究工作刻不容缓。 猪是目前为止已知的PRRSV 唯一自然宿主，此外，病毒感染过程具有很强的细 胞嗜性。完全分化的猪肺泡巨噬细胞（PAM ）是PRRSV 感染的最主要靶细胞。在所 有PRRSV 假定细胞受体中，MYH9 和CD163 蛋白是PRRSV 感染所必需的受体蛋白。 MYH9 在PRRSV 粒子吸附宿主细胞表面，病毒脱壳，释放基因组到胞质的过程提供 桥梁的作用，因此其作为PRRSV 感染的抑制剂具有重要研究价值。 本文采用原核表达系统，选用pClod-SUMO 质粒作为表达载体，通过SUMO 标 签以及低温诱导培养条件促进蛋白的可溶性表达，通过设计引物，目的基因的 PCR 扩增，双酶切，连接及转化成功构建了重组质粒pCold-SUMO-Monkey PRA 。之后将 重组质粒导入到 BL21 （DE3 ）感受态细胞中进行表达，借助镍柱亲和层析的方式进 行纯化，并通过rTEV 酶去除SUMO 标签，经过透析，浓缩等步骤表达Monkey PRA 高纯度蛋白，之后通过ELISA 和Western blot 验证Monkey PRA 蛋白与抗独特性抗体 Mab2-5G2 的结合。为进一步探究Monkey PRA 是否具有阻断PRRSV 感染PAM 和 MARC-145 易感细胞的功能。首先借助ckk-8 试剂盒检测Monkey PRA 蛋白在细胞上 的毒力。再通过Western blot ，相对荧光定量PCR 和TCID50 等方法在病毒蛋白表达水 平和转录水平，以及细胞上清病毒滴度水平来验证 Monkey PRA 蛋白在 PAM 和 MARC-145 易感细胞上是否降低PRRSV SD16 感染。最后通过上述方法进一步验证 Monkey PRA 蛋白对PRRSV 不同毒株阻断感染的影响。 研究结果发现：通过原核表达系统成功获得高纯度蛋白Monkey PRA ，通过ELISA 和Western blot 结果显示：Monkey PRA 蛋白具有良好的生物学活性，可以与PRRSV GP5 蛋白抗独特性抗体 Mab2-5G2 的结合，从而间接证明Monkey PRA 蛋白可以与 PRRSV 相结合。阻断试验结果显示Monkey PRA 蛋白可以有效的降低PRRSV SD16 感染PAM 和MARC-145 细胞。同时Monkey PRA 蛋白对PRRSV 的不同毒株均具有 阻断感染的作用，说明其阻断病毒感染具有广谱性。最终验证得到猴源 PRA 蛋白能 I 西北农林科技大学硕士学位论文 够对PRRSV 感染具有与猪源PRA 类似的抑制作用，对于在细胞水平进一步探究猴源 MYH9 在PRRSV 感染更深层的功能具有启示性的意义。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；Mab2-5G2；猴源MYH9; ；抗病毒 II 目 录 目 录 摘要I ABSTRACT III 目 录V 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其受体的研究综述 1 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究概况 1