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EMSA 实验技术及方法简介 实验简介 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最 初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNA 或 RNA 探针一同保温，在非变 性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或 RNA-复合物比非结 合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当 检测 如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽 提液。在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的 蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或 RNA 片段 和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白 的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。 凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋 白质和 DNA 序列相互结合的技术，最初用于研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列 相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术 目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。 由于很多研究的 TF 不具有结合的特异性，所以即使发现 TF 和被研究的寡核苷酸探针 结合，也不表示在体内该 TF 不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学 软件，可以 模拟表示TF 与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现 TF 可以和启动子区PUTATIVE 结合。 同时，由于 EMSA 在体外不能模 拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一 TF 在细胞内由于受到其它 TF 的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能 重现这一结果的。 2003 年上一篇关于 ChIP 方法的介绍文献攻击 EMSA 没有考虑细胞内完整自然的染色 质结构和调节的影响而受到很大的限制！ 下面是在一个 PROTOCAL 1.探针的标记： (1) 如下设置探针标记的反???体系： 待标记探针 (1.75pmol/微升) 2 微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1 微升 Nuclease-Free Water 5 微升 [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1 微升 T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1 微升;总体积 10 微升 按照上述反应体系依次加入各种试 剂，加入同位素后，Vortex 混匀，再加入 T4 Polynucleotide Kinase，混匀。 使用水浴或 PCR 仪，37℃反应 10 分钟。 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率 在 30％以上，即总放射性的 30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探 针的标记效率。 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存 在-20℃。 2.探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善 EMSA 的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作： (1) 对于 100 微升标记好的探针，加入 1/4 体积即 25 微升的 5M 醋酸铵，再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇，混匀。 (2) 在-70℃至-80℃沉淀 1 小时，或在-20℃沉淀过夜。 在 4℃，12,000g-16,000g 离心 30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉。 在 4℃，12,000g-16,000g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干 燥。 加入 100 微升 TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不 宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在 -20℃。 3.EMSA 胶的配制： 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好 选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可 以选择可灌 制较大 EMSA 胶的模具。 按照如下配方配制 20 毫升 4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr