中国野生山葡萄抗寒基因VaERD15的功能分析与互作蛋白筛选.pdfVIP

摘 要 摘 要 葡萄是世界上最重要的果树树种之一。目前全球广泛栽培的葡萄为欧亚种葡萄 （Vitis viniferaL.），品质优良，但抗寒性差，其生长发育受到低温的严重影响。中国 是葡萄属植物的起源中心之一，野生葡萄资源丰富多样，其中山葡萄 （Vitis amurensis Rupr.）是葡萄属中最抗寒的种，可耐-40℃的低温，是十分重要的抗寒基因资源。发掘 山葡萄抗寒相关基因并研究其功能，对弄清其抗寒分子机制及利用分子手段提高欧亚 种葡萄的抗寒性具有重要意义。 前期本课题组通过寒胁迫构建了中国野生山葡萄抗寒基因的cDNA 文库，获得了 VaERD15 基因的EST 序列；随后克隆了VaERD15 基因，并将其转入拟南芥中，证实 过表达 VaERD15 能提高转基因拟南芥的抗寒性。在此基础上，本研究从抗寒的中国野 V.amurensis acc.Shuangyou VaERD15 生山葡萄 ‘双优’ （ ）中克隆 基因全长，分析该 基因的功能；进一步从山葡萄‘双优’和欧亚种葡萄‘红地球’（V.vinifera cv.Red Globe） 中克隆ERD15 基因CDS上游的999bp 启动子及其缺失片段，分析启动子的顺式作用 元件，并对启动子及其缺失片段进行了瞬时表达分析；最后利用酵母双杂交筛选与 VaERD15 互作的蛋白，以解析其抗寒调控机制。本研究取得的主要结果如下： 1. 根据山葡萄 ‘双优’转录组数据库中得到的VaERD15序列片段，以 ‘双优’cDNA PCR VaERD15 CDS 507bp 169 为模板进行编码区 扩增，获得 的 序列，长 ，编码 个氨 基酸，含有1个PAM2结构域。序列比对显示，VaERD15与欧亚种葡萄‘红地球’VvERD15 序列相似度高达99%，仅有一个碱基发生突变，说明了ERD15 基因调控的葡萄抗寒性 主要与其启动子有关。亚细胞定位结果显示，VaERD15 定位于细胞核及细胞膜；转录 激活活性分析表明VaERD15 无转录激活活性。在4℃低温处理后，ERD15在 ‘双优’ 和 ‘红地球’中表现出对低温不同程度的响应，在 ‘双优’中ERD15 受低温诱导表达 3h ERD15 变化比 ‘红地球’中显著，在冷胁迫 时 ‘双优’中 的表达量是 ‘红地球’ 中的20.3倍。 2. 从 ‘双优’和 ‘红地球’基因组DNA 中分别克隆ERD15 CDS上游999bp 及其缺失 GUS 4 ABA 片段，然后分别构建 融合表达载体，进行瞬时转化本氏烟草叶片，经 ℃、 、 SA 和PEG 处理后进行表达活性分析。GUS染色结果表明PVaERD15 （VaERD15/p999）和 PVvERD15 （VvERD15/p999）及其缺失片段在4℃、ABA、SA 和PEG 处理下均具有活性， P P 但由于受启动子所含顺式作用元件的种类及数量的影响，VaERD15 和 VvERD15 及其缺失片 段活性强弱不一致。在4℃和ABA 处理后，PVaERD15 和PVvERD15 活性强于SA 和PEG 处 理，表明PVaERD15和PVvERD15受低温和ABA胁迫的影响大于SA和PEG。PVaERD15和PVvERD15 及其缺失片段均受ABA 诱导，表明其对低温的响应可能与ABA 信号途径有关。 ‘双 Ⅰ 西北农林科技大学硕士学位论文 优’和 ‘红地球’启动子中第一个缺失片段 （VaERD15/p68