牛精子特异性高表达Bta-miR-182靶向CFL1促进早期胚胎发育.pdfVIP

摘 要 摘 要 微小RNA （miRNA ）是一类非编码单链RNA 分子，长度约为18~24 nt。miRNA 通过调控基因的转录水平、mRNA 的稳定性以及转录后翻译等过程。影响基因的表达， 在细胞凋亡、细胞分化、衰老、癌变等过程中产生重要的影响。在克隆牛胚胎的发育 过程中，可能会出现胚胎发育异常的现象，例如发育阻滞以及胚胎形态和质量异常等， 尤其在克隆牛胚胎发育的早期容易发生异常。可能是因为克隆胚胎中没有精子的参与， 缺失精子来源物质的调控，从而引起克隆胚胎的异常发育。因此对精子特异性高表达 的miRNA 可能在牛胚胎早期发育过程中起到的作用进行研究。本试验取得的主要结果 如下： 1. 通过miRNA 定量确定Bta-miRNA-182 为精子特异性高表达的miRNA ，并通过 生物信息学方法筛选出靶基因ACVR1 、CFL1 和ZFP36L1 ，可能在早期胚胎发育中起 调节作用。 2. 分别构建了靶基因ACVR1 、CFL1 和ZFP36L1 的双荧光报告载体，使用双荧光 素酶报告基因法检测靶基因的表达量。使用Lip 2000 进行靶基因质粒和miRNA mimic 的共转染，转染至293T 细胞。与对照组相比，miRNA-182 mimic 共转染组的CFL1 及 ACVR1 的荧光强度明显降低(p0.05)，而ZFP36L1 的荧光强度变化不明显。之后通过 实时定量PCR （qPCR ）检测ACVR1 、CFL1 和ZFP36L1 的变化情况，结果显示CFL1、 ZFP36L1 在与miRNA-182 共转染以后表达水平明显降低(p0.05) 。结合基因的相关功 能分析，筛选CFL1 为miRNA-182 的靶基因。Western Blot 试验将mimic 电转染至成 纤维细胞，试验结果表明，与Negative control mimic (NC mimic)和inhibitor 组相比， miR-182 mimic 电转染组中 CFL1 的蛋白表达水平显著降低(p0.05)，证明 CFL1 为 miRNA-182 的靶基因。 3. 按梯度浓度注射miR-182 mimic 到胚胎中，通过qPCR 筛选出最合适的miR-182 mimic 浓度。对早期胚胎注射最适浓度的miR-182 mimic，免疫荧光染色结果显示胚胎 2-细胞和4-细胞时期的CFL1 的表达水平显著降低(p0.05) 。鬼笔环肽染色结果显示， miR-182 mimic 注射组2-细胞和4-细胞时期的肌动蛋白表达水平显著升高(p0.05) 。说 明miR-182 通过靶向CFL1 调控肌动蛋白的表达。此外，与SCNT、孤雌胚胎的卵裂时 间相比，miR-182 mimic 注射组更接近 IVF 胚胎，注射后提高了胚胎的发育囊胚率 (p0.05)，降低了胚胎囊胚凋亡细胞数(p0.05) 。然后筛选出对CFL1 具有明显抑制作用 的小分子干扰RNA 片段si-429 ，注射si-429 后发现2-细胞时期CFL1 的表达水平明显 降低(p0.05)，囊胚率明显升高(p0.05) 。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 试验表明，精子特异性高表达的 miR-182 通过对靶基因 CFL1 的调控，影响肌动 蛋白的表达，与IVF 胚胎的卵裂时间接近，提高了早期胚胎的发育囊胚率。 关键词：早期胚胎发育；精子特异性高表达；Bta-miR-182；丝切蛋白1；肌动蛋白 II 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACT III 文献综述 1 第一章 miRNA 的研究现状 1 1.1 miRNA 的特征 1 1.2 miRNA 的生成及加工机制 2 1.3 miRNA 的生物学功能 2