猪δ冠状病毒西安野毒株的分离鉴定及其M蛋白的免疫原性研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 猪δ 冠状病毒（Porcine deltacoronavirus ，PDCoV ）是一种新发现的肠道冠状病毒， 能引起新生仔猪腹泻、呕吐、脱水、死亡，致死率能达到30%~40% ，严重降低了新生 仔猪的存活率，影响了养猪业的发展。在我国已经有多个省份分离了PDCoV 地方株， 但至今未见 PDCoV 陕西地方株分离的报道。成功分离 PDCoV 地方株对陕西地区 PDCoV 发病机制研究、病毒学和血清学分析以及疫苗开发具有重要意义。表达PDCoV 的结构蛋白为后续开发诊断试剂和潜在的PDCoV 亚单位疫苗提供了基础。 本试验采集陕西省西安某猪场腹泻仔猪的肠道及内容物，利用猪睾丸 （ST）细胞 进行病原分离，细胞出现明显病变时，利用RT-PCR 方法扩增PDCoV 西安株M 全基 因序列并测序，探究其B 细胞表位是否发生改变。将M 基因与表达载体pET-32a 构建 重组质粒，转入到BL21 （DE3 ）菌株诱导表达，以纯化的重组蛋白免疫小鼠制得多克 隆抗体。本研究取得如下结果： 1. PDCoV 分离株盲传5 代，感染ST 细胞72 h 后出现细胞病变，主要表现为细 胞变圆、变大、聚集和脱落。RT-PCR 检测显示 PDCoV 阳性，命名为 CHN- -5.81 XA18-35 株。F5 代细胞毒在ST 细胞的TCID50 为10 /100µL。 2. 该分离株的 M 基因与其他地区参考株的核苷酸相似性为 98.47%~99.54%，氨 基酸相似性为97.24%~99.08% 。M 蛋白第189 位氨基酸由异亮氨酸（Ile ）突变 为精氨酸（Arg ）。 3. 构建了M-1-pET-32a 重组表达载体，得到优化的表达条件是诱导温度25℃，诱 导剂浓度0.5 mmol/L ，诱导时间20 h 。表达的重组蛋白分子量约为34 ku 。 4. 重组蛋白经纯化免疫小鼠制得抗血清，中和抗体效价为 1:179。可以用作间接 免疫荧光法来检测猪δ 冠状病毒。 结论： 1. 成功分离并鉴定了PDCoV 陕西地方株，M 蛋白第 189 位氨基酸的突变，对其 B 细胞表位未产生影响。 2. 重组蛋白有良好的的免疫原性，PDCoV-M 抗血清有较好的中和效应。 关键词：PDCoV ；分离；M 基因；原核表达；抗血清 I 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACT I 第一章 猪δ 冠状病毒的研究进展 1 1.1 病原学及基因组 1 1.2 流行病学及病理特征 3 1.3 分离培养与致病机理 4 1.4 宿主免疫反应 5 1.5 诊断 6 1.6 预防与治疗 8 1.7 蛋白表达 8 1.8 本研究的目的和意义 9 第二章 猪δ 冠状病毒西安株的分离鉴定及序列分析 10 2.1 材料 10 2.1.1 病料 10 2.1.2 细胞与菌株 10 2.1.3 主要试剂 10 2.1.4 主要仪器 11 2.2 方法 11 2.2.1 病料处理 11 2.2.2 引物设计与病原检测 11 2.2.3 病毒分离 12 2.2.4 测定病毒效价TCID50 12 2.2.5 M 基因的克