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位嵋 U字杂志,2010,20(2:47-,,48,50 @2010CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION RNA聚合酶II启动子shRNA表达 载体构建的研究进展 周天龙1王会敏2综述周青霞1审校 ［中周分类号］R34［文献标识码］A ［文章编号］1005—1740(201002一 0047 一 03 置蚕虢瑟蔫主戮翳 1RNA聚合酶II启动子调控的RNAi中的效应分子及作 用机制 有两类RNA分子参与 RNAi:小干扰 RNAs(siRNAs和miRNAs。前者主要由 RNA聚合酶III启动子启动表达，而后者为聚合酶11启动子表达调控。 miRNA是一类长约22个碱基的非编码RNAs,它们与信使RNA结合并调控其 翻译或将其降解口 ］。对模式生物 秀丽新小杆线虫、果蝇的研究结果显示，生物体内 天然存在miRNA基因，在细胞核内转录生成含有几百个或几千个核苷酸的原始 miRNA(Primary miRNA,pri-miRNA。由 RNAseE 家族的 Drosha切割生成 miRNA 前体(Precursor miRNAs,pre-miRNAs,pre-miRNAs 长 70nt,3 端有 2 个核苷酸的突 出。随后，其在Exportin5的协同作用下进入 细胞质并被Dicer转变为成熟的 miRNA。接着,miRNA 与 RNAi 诱导沉默复合物(RNAi-lnduced Silencing Complex, RISC中的Argonaule-2(其能选择性地组装那些5末端结 ［作者单位］,咸宁学院附属第二医院检验科，邮政编码成宁437100;2广东省中医 院二沙岛分院检验科 本文 2010--01--20 收到.2010— 03—12 修回,2010-03— 24 接受 c砸U字杂舂 2010年荒20卷第2舶构疏松的RNA链结合，一旦进行到这一步骤，RISC即会 发挥下调同源mRNAs表达的作用。当miRNA与mRNA完全同源时，其能降解 mRNA,而当其与mRNA不完全同 源时,其会在翻译水平下调基因的表达口 J］。在人 类,迄今已经发现了大约470种miRNA,并且还在哺乳动物中对其进 行了许多研究 ［5 6］研究认为每种miRNAs能调控数百种信使RNA,但miRNA的靶基因仍没有 被鉴别出来［7］。 2miRNA与s诹NA的相似点及不同点 miRNA与RNAi经典途径中的siRNA存在一些相似 点及不同点阳.9］.相似 点:(1siRNA和miRNA都由Dicer产生;(2两者都由22个核苷酸组成；(3两者都能与 一些核酸酶一起形成RISC。不同点:(1siRNA通常来源于动物RNAi中或是植物转 录后基因沉默中的长双链 RNA(Long Double-Stranded RNA,dsRNA,而miRNA则是 内源性的；(2siRNA被Dicer处理后形成3末端悬挂两个核苷酸的双 链结构，而 miRNA在通常情况下是单链结构［1们｝(3siRNA被组装为RISC后能降解靶mRNA, 而miRNA常常不降解 靶mRNA,而是在翻译水平下调相应基因的表达［11 3细4 胞内主要结构性的含22个核苷酸的RNA是miRNA,而siRNA通常在病毒感染或 dsRNA被人工引入细胞内及转 座子被激活后被诱导产生，因此siRNA主要在抑制转 座子的活动和病毒感染中发挥作用。 3RNA Pol 111启动子驱动的shRNA表达载体的缺点 经化学合成的siRNA被转染到细胞内，能发挥沉默基 因的作用，但因其量少，只 能在细胞内发挥短暂的效应，且由于其合成成本高，在一定程度上限制了其应用。而 shRNA在结构上与内源性miRNA前体相似，其进入细胞后被Dicer处理为21个核 苷酸的siRNA或miRNA而发挥RN加效应。尽管shRNA载体作为一种工具已被 广泛用来分析基 因的功能，但现有的shRNA载体却存在一些缺陷。如每个 shRNA 只能表达一个shRNA,所以,抑制多个基因就需要有多个启动子或载体，甚至在相同 载体转染时。多个shRNA也不能达到相似的共表达水平。另外，对引入的shRNA 的 综迹? 周天龙.王会敏 检测需共表达一个由RNA Pol II启动子驱动的报告基因,这种情况下，标记基因 的表达并不总是与shRNA的表达相一致。还有，调控RNA Pol III启动子的表达比 调控RNA Pol II启动予的表达更为困难。而含 RNA Pol II启动子的RNAi表达载体 能够克服RNA Pol III启动子的缺陷［1。“ 4含RNA Pol II启动子的shRNA表达载 体的构建及应用4.1利用miRNA前体的干袢环结构作为合成 miRNA的骨架 4.1.1用rnir-30前体作为骨架：