最新版南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆.docx

绿色荧光蛋白（EGFP的基因克隆南方医科大学 学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳 定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含 有目的基因GFP的 pEGFP-N质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、 转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌 DH5a （克隆菌）中，从而实现 荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词 ：绿色荧光蛋白 克隆 表达 实验名称 绿色荧光蛋白的基因克隆 2015-? 实验日期 实验地点 2015- 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 一、 实验目的 学习使用限制性内切酶进行 DNA酶切的原理和方法。 学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 掌握PCF技术原理和PCF仪的操作方法。 学习PCF产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及 DNA专化大肠杆菌的原理和方 法。 掌握双酶切法鉴定重组 DNA勺基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA勺基本原 理和方法。 掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1. pEGFP-N质粒 pEGFP-N1 Vector Information PT3027-5Catalogf?oOTM I[J65&砂LIMilJVof I J'.. PT3027-5 Catalog f?oOTM I [J65& 砂LI Mil JVof I J'.. JralU - SnuB \ 1^111 ■ ** H * * 科峠亠 *■■■? JI A ■ ?■? 一 扌 ! ■■- . ?■ I.-. ■ - ■； 1- - - ；. - -I - ■- 丁 ： ■.； : ■ 1 ：-：.：. - 2 ■ - ” I 二-I： .■■■□；■ 兀：：:i ：：■；'.：川 島巧 CTR *rl Hl JTMi _ , ?flf in fee* I 勾川 Ml 冲节 SjpmI 伽■ 謔. 2轲叩為L则霊 He-stricGiEMi M-ap >nd MuitipliD Clowning Site of pEGFP-W t VttGtor. (tir-que nsstncaan a^ts-3 ara in boc ；i Tho iS'or I n? fattOM lh? E?FP ? gfcntfoa Th* 血 I ?i ?⑴ it rwh^Mtd m &NA awGm IhrCLONiTECH ?，you wuh to ^gwt div vtdQr wilh 油科 enzymi, ydu Hill MW Id UMFonm ? HCtor 冋口 ■加眄 1 目 mtM rmih ^NA. 2. T载体 on on 三、材料与方法: 实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T 载体：pUCm-T 菌种：DH5 (克隆菌) PCR引 物: F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白 T载体(pMD18-T vector cloning kit ) 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I ( Fermentas) Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG 等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机, PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、 超低温冰箱等 方法 分离目的基因一限制酶切割目的基因与载体一连接重组体一转入受体细胞一筛选重组体、 转化子 四、实验具体流程 1. 获取外源基因 1) 碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒 菌液 离心 1300r pm,1mi n ? 弃上清 瞬时离心 ? 彻底弃上清 漩涡震荡 颠倒数次 加250卩I溶液S1 加250卩I溶液S2 悬浮沉淀 加350卩I溶液S3离心 加350卩I溶液S3 离心 放置3-5min 离心 13000rpm,10min 取上清600卩I加到吸附柱中 13000rpm,1min 离心离心 离心 2)PCF 2) PCF扩增目的基因GFP 空柱离心 ■ 放入一个干净的离心管 离心 中，在吸附膜的中间加 PCR扩增/ -20 C保存备用 13000rpm,2mi n 13000rpm,1mi n 40卩I洗脱液 弃滤液，加入600卩I洗涤液W 13000rpm,1min 弃滤液 *弃滤液，加入600卩I洗涤液 W l3000rpm,1mih 取0.2 mI PCR反应管一支，