感受态细胞制备.pdf

精品文档 感受态细胞制备 一、 实验目的 1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术； 2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法； 3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。 二、 实验原理 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应 的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。 质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基 因。细菌吸收外源 DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在 其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处 于感受态 ,如大肠杆菌。 大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于 0 ℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的 细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是 CaCl2 能使细菌细胞壁 的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成 孔洞，使外源 DNA 进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法 8 高出 1 到 2 个数量级，达到 1 x 10 转化子每 1 μg DNA，甚至 1 x 109 转化子每 1 μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、 快速、稳定、 重复性好， 菌株适用范围广， 感受态细菌可以在 -70 ℃ 保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌 的感受态，依靠短暂的电击，促使 DNA 进入细菌，转化率最高能达到 109 ~ 1010 转 化子 / μg 闭环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化率（转化子数／每 μg 质粒 DNA）＝转化子总数／质粒 DNA 加入量 ( μg) 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为 1*10 10 三、实验材料 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、 LB 液体培养基、 实验试剂： 0.1M CaCl 溶液、含 10%甘油的 0.1M CaCl 溶液、 GYT、三蒸水、 10%甘 2 2 油的水溶液、 DH5 α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。 三、 实验步骤 （一）化学感受态细胞的制备 （1）菌种的活化：取 -70 ℃的冰箱中感受态细胞 DH5 α、Top10、 DE3、 BL21 在 LB 的平板上进行划线分离。 （2 ）菌种的前培养：