《生物物理学》荧光光谱.ppt

荧光探剂的特点： 量子产率随环境的改变而改变，而且变化很大。它在特定环境下发强光。 例如：1.6-二苯基、1.3.5-己三烯(DPH)在水中荧光很弱，一旦插入膜脂双层，φ↑ * 紫外-可见 吸收光谱 以光子形式重新发射电磁波 荧光的 偏振度 强度 荧光 光谱 寿命 与被研究物质的 结构 构象 物理状态 分子运动 密切相关。 激发波波长λ 发射波波长λ 一.荧光的产生 吸收 内转换：非辐射过程 丢失能量 荧光：以光子形式释放能量 基态S0 第一电子激发态S1 第二电子激发态S2 二. 荧光光谱中的参量 1. 量子产率（发光效率）φ： 吸收光子数 发射光子数 φ：表示某种物质的发光本领。φ越大，发光本领越高。 φ ＜1 同一物质在不同环境下，φ不同。 φ= 照射I0 吸收 发射 F λex 2. 荧光强度 —— 在一定激发波长λex 作用下，发射的荧光强弱。 F =φI0（1-10-εcl） 当样品浓度 c 很低时，10 –εcl 1-εcl F=φI0εcl F与c成正比。 当样品浓度 c 较大时，10 –εcl 可以忽略， F=φI0 F与c无关。 实际测量时由于浓度增高，荧光分子碰撞过多，F反而被淬灭。 应用荧光进行定量分析时，应采用正比区域的浓度较低的范围。 3. 荧光光谱 激发谱：F与激发波长的关系。 发射谱：F与发射的荧光波长的关系。 由于荧光物质有两个特异谱，因此对物质进行定性分析时，比吸收谱更为准确。 F λex λem 4. 荧光偏振 荧光物质发出的荧光，其电场矢量的方向不象自然光在各个方向，也不象偏振光只在一个平面内振动，介于两者之间，具有一定的偏振性，是部分偏振光 ——荧光偏振。 荧光偏振度P —— 衡量荧光的偏振程度。 I∥－ I⊥ I ∥＋I⊥ P = 起偏器 检偏器 I∥ I⊥ 检偏器 起偏器 I ∥ 荧光偏振度P 的物理意义： I∥= I⊥，P =0，荧光的电场矢量各个方向都有，类似自然光。只有当荧光分子运动很快，趋向随机时才会出现。荧光分子在稀溶液中才会出现。 I∥或I⊥=0时，P =1，荧光电矢量为一个方向，是平面偏振光。只有当荧光分子排列非常有序时或运动很慢时才出现。 I∥≠I⊥≠0，0＜P ＜1，样品发出的荧光为部分偏振光。分子的运动或排列的有序程度介于以上两种情况之间。生物大分子属于这种情况。 5.荧光寿命 τ：荧光强度衰减为原来的1/e所需要的时间。 表示分子处于激发态时间的（平均值）的长短。它与分子所处环境、有无淬灭和能量转移以及分子间的相互作用有关。 6.荧光探剂： 发荧光分子通常具有环状共轭双键即π电子系统。 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸具有环状共轭双键。 脂质以及脂组成的膜系统无荧光特性。 核酸除碱基外也不发光。 利用荧光探剂标记到无荧光的分子或系统内，以研究无荧光分子的特性——荧光标记。 例如： DPH标记膜脂区 ，可以研究膜脂区的流动性。 溴化乙锭（EB），在水中荧光很弱，但插入DNA双螺旋基对之间区域后，荧光大大增加。利用这一特性可进行DNA的定性和定量分析。 探测细胞内Ca2+的探剂fiuo-3。 目前荧光探剂的种类成千上万，广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、膜、核酸以及细胞的结构与功能的研究。 应用： 1. 物质的检测 特点：灵敏度高，样品量少，对纯化的要求低，测量方便，快速。 5-HT的中性或弱酸性溶液用λex=295nm激发，荧光峰λem=330nm。加HCl时出现550的峰，330的峰减弱。 ——测量组织和体液中的含量。 荧光