《生物物理学》电镜制样.ppt

超薄切片 载网类型 透射电镜样品制备程序 超薄切片染色—— 电镜图像的反差实质上是电子密度的差异，它是由于样品不同部分对电子束的散射能力不同而形成的。 散射的电子束越多，图像越暗。 超薄切片染色就是利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使细胞内各结构对电子产生强散射能力，从而增加反差。 醋酸铀30-40分钟， 柠檬酸铅5分钟。 冷冻蚀刻与复形技术 标本先置于低温下冷冻，再将其断裂，暴露出内部结构，然后在断裂面上制作复型膜。 研究细胞的各种膜结构： 质膜、核膜、内膜系统 在冷冻断裂时，由于标本质地硬与脆，在受到断裂刀打击时，标本不是被刀切断，而是顺着外力方向断裂开，断裂处一般是在膜的薄弱处即膜结构的疏水层处裂开。 因此冷冻蚀刻法可以从不同角度、不同层次大面积地暴露出膜的表面结构。 将标本放入液氮中冷冻 冷冻后的标本放到真空喷镀仪中用特殊的装置快速断裂 在真空中升温使断裂面上冷凝的水分升华 微结构暴露 在断面上喷镀铂和碳，制成铂碳复型膜 将粘在复型膜上的组织清洗干净，用透射电镜观察 扫描电镜样品制备 生物样品扫描电镜制样的基本程序 取材：注意保护观察面。与透射电镜样品取相似，样品可大些，观察外表面的样品，其直径不超过5mm，高度可在3~5mm；观察内表面的样品，其直径应小于2mm，高度在3mm左右。 清洁表面：清除表面的粘液、分泌物、组织液、血液及细胞碎片等附着物，充分暴露样品表面。根据样品的特点，选用适当的清洗液. 前固定：2.5%戊二醛，1~3h,4 ℃ 。 清洗：磷酸缓冲液，10~15min，各3次。 后固定：1%锇酸0.5~1.0h, 4 ℃ 清洗：同前 脱水：酒精梯度脱水， 30%~50%~70%~80%~90%~100%(1) ~100%(2)各15~30min; 干燥：临界点干燥法 镀膜：真空镀膜法和离子镀膜法 观察：扫描电镜观察、照像（存图） SEM扫描制样流程图 临界点干燥法 离子溅射（金属镀膜） 噬菌体复染 腺病毒负染 乙肝抗原负染 按样品类别： 超薄切片 冷冻蚀刻的复形膜 悬浮样品的滴片 培养细胞等 按研究内容： 对细胞膜上的抗原或抗体进行免疫标记 追踪细胞中某些大分子的放射自显影标记 对细胞中的某些生化成分作定位、定性、 定量研究 细胞膜、细胞器的超微结构进行观察 样品要很薄（纳米）； 良好保存精细结构； 样品具一定反差。 对于TEM观察的生物样品的特殊要求： 生物常规样品透射电镜制备技术 ——超薄切片技术 超薄切片技术的基本操作程序 取 材 预固定 后固定 脱 水 浸 透 包 埋 修 块 切 片 染 色 取材——按“快、小、轻、准、冷”的原则， 在切断血供1-2分钟之内将放入固定液。 超薄切片的基本操作程序 固定—— 用物理或化学的方法迅速杀死细胞，使组织细胞的形态结构尽可能地保存在接近其生活时的状态。 前固定 2.5-4%戊二醛冰箱保存或送电镜室，2小时后改刀为≤1mm3的样品。 主要对糖原、核酸、尤其是对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用。 漂洗 —— 0.1M磷酸缓冲液 10~15分钟，3次。 后固定： 1%锇酸。 主要对脂类、蛋白质进行固定。 漂洗与脱水—— 漂洗：0.1M磷酸缓冲液 10~15分钟，3次。 用能与水和包埋剂相混合的 有机溶剂（乙醇和丙酮），除去 组织中的游离水，使包埋剂能均 匀渗透入组织块内。 脱水： 乙醇或丙酮梯度脱水：50%、70%、80%、90%各10-15分钟/次，100%10-15分钟/2次。 浸透与包埋—— 组织块在脱水后，需用一种常温下为液态，经过加温聚合后具有一定硬度的介质对其进行处理，使处理后的组织有适当的硬度和良好的切割性能。 包埋剂：DDSA、MNA、Epon812、DMP30 浸透 ： 丙酮：包埋剂 = 1：1； 丙酮：包埋剂 = 1：3 ； 纯包埋剂浸透1-3