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2016-11-16;Western blot 定义;Western blot 原理; 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。
;Western Blot操作流程;水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液
对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。
细胞裂解液: 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 , 0.05% PMSF , 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin , pH8.0
有机溶剂提取法
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。;蛋白样品的定量(Bradford法 );BCA蛋白浓度测定试剂盒; 20-30 ug 细胞/组织裂解物
100 ng 纯化蛋白
根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量
上样量一致:每孔上样量保持一致
上样前用loading buffer加热变性样本
;;;四、Western Blot 转膜;Western Blot 的具体步骤;制作“三明治”
“黑胶白膜”;Western Blot 的具体步骤;Western Blot 的具体步骤;五、封闭;六、一抗、二抗孵育;七、二抗与底物反应显色;Western Blot 需要的主要试剂;主要试剂;4. 10%过硫酸胺(AP)
过硫酸胺 0.1g
蒸馏水 1ml
(现用现配,可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中,一次性多装几管,使用时加入蒸馏水水即可,溶解后,4℃保存,保存时间为1周)
5. 四甲基乙二胺原液(TEMED): 4℃保存。
6. 30%丙稀酰胺: 4 ℃保存。
7. 5X电泳液缓冲液
Tris(MW121.14) 15.1g
甘氨酸(MW75.07) 94g
SDS 5.00g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍,通常取160ml配制成800ml即可。
8. 10X转膜缓冲液
甘氨酸(MW75.07) 151.1g
Tris(MW121.14) 30.3g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍,并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液,加560ml蒸馏水,最加160ml甲醇,配制成800ml即可。
(先加甲醇易产生沉淀);9. 10XTBS缓冲液
Tris(MW121.14) 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至 1000ml
(浓盐酸调pH至7.6),溶解后室温保存。
10.1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏水 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠,应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块,即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11.封闭液/抗体稀释液(5%脱脂牛奶):
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存,可于一周内使用。
;WB需要试剂-膜;;主要目的是确定靶蛋白的分子量大小;使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况,并可以转移到膜上。;WB需要试剂-一抗;杂交需要试剂-二抗;杂交需要试剂-底物;结果分析;;使用Photoshop 检测灰度值;;;;WB常见问题;标本问题
标本中不含检测蛋白:设置阳性对照
上样量不够,或者蛋白表达丰度比较低:增加上样量
转膜问题
转膜不完全:转膜后使用丽春红染色,确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上,使用蛋白质Marker.
洗涤过度:减少洗涤时间和次数.
封闭
封闭过度:减少封闭试剂浓度,封闭时间,更换封闭试剂
抗体孵育和检测
抗体浓度和时间孵育不够:增加抗体浓度,延长孵育时间
一抗不工作:设置阳性对照
二抗不工作:和其他一抗配合检测二抗是否工作
一抗/二抗不匹配:检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗
底物失活:重新配制有效的底物;背景高;非特异性条带;Thank you!;9、春去春又回,新桃换旧符。在那桃花盛开的地方,在这醉人芬芳的季节,愿你生活像春天一样阳光,心情像桃花一样美丽,日子像桃子一样甜蜜。7月-207月-20Thursday, July 16, 2020
10、人的志向通常和他们的能力成正比例。13:23:4813:23:4813:237/16/2020 1:23:48 PM
11、夫学须志也,才须学也,非学无以广才,非志无以成学。7月-2013:23:
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