基因工程制药9.ppt

第十一节 变性蛋白的复性 ? 一、包含体形成的原因： ? 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白正确折叠 的速率就形成包含体；重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺 乏一些折叠酶和分子伴侣形成包含体。 二、包含体的分离和溶解 ? 1. 包含体的分离：重组菌破碎、洗涤，蔗糖密度梯度离 心法纯化 ? 2. 包含体的溶解：用强变性剂（盐酸胍、脲）或去垢剂 （ SDS ） 三、包含体蛋白复性方法 ? 1. 稀释、透析复性法 ? 2. 含二硫键的蛋白的复性 ? 3. 封闭蛋白的疏水簇促进复性 ? 4. 凝胶过滤层析复性 ? 5. 小分子添加剂促进的复性 ? 6. 折叠酶或分子伴侣促进的复性 ? 7. 人工分子伴侣促进的复性 第十二节 基因工程药物的质量控制 ? 基因工程药物是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并 有复杂的结构。参与生理功能的调节，用量极微。 ? 宿主细胞中表达的外源基因，在转录、翻译、精制、工艺放大过程 中可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和 鉴定质量。 ? 《中国生物制品规程》中国生物制品标准化委员会， 2000 ， 10 ， 1 执行。 一、医药生物技术产品质量保证的一般要点 ? 1. 产品安全性评价 ? 2. 产品本身的结构 ? 3. 严格控制条件 二、 原材料的质量控制 ? 确保编码药品的 DNA 序列的正确性 ? 重组微生物来自单一克隆 ? 所用质粒纯而稳定 ? 保证产品质量的安全性和一致性。 根据质量控制要求应了解以下特性： ? ⒈目的基因 的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图 谱和核苷酸序列予以确证； ? ⒉表达载体 的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复 制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图 谱，抗生素抗性标记物； ? ⒊宿主细胞 的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性； ? ⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合 后的遗传稳定性； ? ⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细 叙述在生产过程中启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法 及水平。 三、培养过程的质量控制 ? 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； ? 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无 突变； ? 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； ? 始终能排除外源微生物污染。 ? 生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因 子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立 生产用工作细胞库。 ? 原始种子批须确证克隆基因 DNA 序列，详细叙述种子批来源、方式、 保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 ? 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控 制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细 胞 - 载体系统稳定性，确定最高允许传种代数； ? 在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培 养后的基因型特征；依宿主细胞 - 载体稳定性与产品恒定性，规定 持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。 ? 培养周期结束时，应监测宿主细胞 - 载体系统的特性， 例如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度， 含插入基因载体的酶切图谱等。 四、纯化工艺过程的质量控制 ? 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分 子批间保持一致性； ? 外源蛋白质、 DNA 与热源物质控制在规定限度以下。 ? 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病 毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有 检测方法。 五、目标产品的质量控制 ? 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求 : ? 产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 ? 需要用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分 子生物学等多学科的理论与技术建立鉴定方法。 1. 生物学活性测定 ? 需通过动物体内试验和体外细胞培养进行效价测定。 ? 国际单位 ? 蛋白质的比活性：效价 /mg.pro, 不仅是含量指标也是纯度 指标。 2. 产品的理化性质鉴定 常用的鉴定方法 : ? 电泳方法 : SDS、等电聚焦、免疫电泳 ? 免疫学方法 : 放射免疫 (RIA) 、酶联免疫 (ELISA) 受体结合试验 ? 高效液相色谱 (HPLC) 、肽图分析法、末端序列分 析、 圆二色谱、核磁共振 ? （ 1