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病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞， 通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率， 以达到目的基因的高效瞬时 表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒 为例。 慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具 有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可 有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多 种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究， 效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建， 能够反 式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、 逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及 在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞， 即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装 质粒可提供所有的转录并包装 RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋 白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心 取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后， 经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等 ，能大大提高 目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加， 这就 为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转 细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基 础。 、慢病毒载体构建及包装流程： （一）实验流程（1和2为并列步骤） 1?慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点， PCR（采用高保真KOD 酶，3K内突变率为0%）从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS区（coding sequenc0连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装 入慢病毒过表达质粒载体。 慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3?慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行 高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基， 培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液 通过超离心浓缩病毒。 （二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的 ZsGreen1 表达框能 表达绿色荧光蛋白（GFP）。 细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培 养基为DMEM（含10% FBS）。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DHa。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 、慢病毒转染细胞实验方法 （一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法 1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1 X105/孔铺到24孔板中。使细胞在 慢病毒转染时的数量为2X105/孔左右。 2、 第二天，用含有6卩g/ml polybren的 2ml新鲜培养基替换原培养基，加入 适量病毒悬液。37 T孵育。 3、 （对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）4小时后加入2ml新鲜培养基以 稀释 polybrene。 4、 继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培 5、 继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染 48小时后可见明显荧光 表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后 72-96小 时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染 3-4天后 开始加药。 （二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法 1、在2X105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6卩g/m和适量病毒，充分混匀。 37C孵育。或者150g室温离心4小时（选作，部分难转染的细胞系采用此步 骤可以提高转染效率）。 2、