共聚焦操作流程.pdfVIP

一、实验环境 观察仪器是否有外表明显损坏，如需开启空调，一般控制 25 度。拉上窗帘，避免标 本荧光淬灭及杂光干扰。 二、开机 查看实验记录，确认是否马上能开机（注意：汞灯必须在关机 20 分钟以后才能再开启， 一般为 30 分钟）。确认后可执行以下操作： （务必先开电源，后开钥匙！！！）。 1、打开 PSU （主电源） 2、打开激光器 （只开启需使用的激光器） 1）、氩离子多线激光器（458/488/515 ，应用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP 等）。 2 ）MCPSU 半导体综合激光器（LD405 应用染料：DAPI/Hoechst/BFP 等；LD635 应用 染料：CY5/ Alexa647 等）。 3 ）LD559 激光器 （注意：电源打开后不要马上开钥匙，等待TEMP 指示灯不闪烁后， 再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用）。 3、打开显微镜电源 IX2-UCB 4 、打开荧光汞灯（注意：开启后，“15 分钟内勿关”） 5、打开电脑主机、显示器，登陆 windows xp 系统，双击共聚焦软件，打开 FV10-ASW 应用软件。 三、取图 1、 DIC （微分干涉差）明场立体图 （1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC 滑块）。 （2 ）、FV10-ASW 软件中点击透射光观察按钮，打开卤素灯快门，使用 TD 滑块（软 件 TD lamp 项）控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦。 1 ）、使用手控面板选择合适倍率的物镜下观察 （注意若用 60 ×油镜时，检偏 镜部位要推上弯杆），并检查各物镜对应的 DIC 元件。 2 ）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度的调节。（需要时可使用，一般勿调） （3 ）、FV10-ASW 软件中点击透射光观察按钮，关闭卤素灯快门。打开 DIC 通道，执 行取图操作。 1 ）、调节扫描速度至最快（2.0us/pixel ），size 为 512by，点击 ，进行快速预扫， 寻找焦平面。 步骤：适当调节 HV、gain 及 offset 参数（一般为能看到图像即可），快速调节寻找焦 平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击，停止预扫描。 2 ）、选择AutoHV ，放慢扫描速度（扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比 好，但耗时，易淬灭，一般为 10-12.5 us/pixel），size 为 640by，点击进行再预扫，调节 HV、 gain 及 offset 参数至图象清晰尖锐即可。点击，停止预扫描。 3 ）、若背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫 描时间也越长，一般 HV 较高时使用）。 4 ）、点击进行取图，并保存。（注意：原始图像一定要保存为oib 格式） 5 ）、去掉，将扫描速度、size 恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端， 2.0us/pixel，size 为 512by ），为下一个标本做好准备。 2、荧光图 （1）、拉出检偏镜(DIC 滑块)，打开汞灯机械快门（shutter ）。 （2 ）、FV10-ASW 软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本， 进行标本聚焦（找视野）。 使用手控面板，根据标本荧光探针选择合适的荧光虑色片及选择合适的物镜下观 察，WU 紫外激发/蓝色荧光（eg ：DAPI），WB 蓝色激发/绿色荧光（eg ：FITC、EGFP），WG 绿色激发/红色荧光(eg:Texas Red，Rhodamine，DsRed)。（一般要求标本在所用的各种荧光探 针匹配的荧光虑色片下均能观察到所需视野，eg ：DAPI＋FITC+ Texas Red 多色荧光探针，需 WU,WB,WG 下均能观察到所需视野，DAPI 一般荧光较强，FITC 或Texas Red 下易找些）。（注 意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用 60 ×油镜时，要插 入检偏镜并推上弯杆。） （3 ）、FV10-A