6.1 转化子的筛选和重组子的鉴定.pdf

转化子的筛选与重组子的鉴定 LOGO 转化子的筛选与重组子的鉴定方法 1、基于载体遗传标记的筛选与鉴定 ，如抗药性筛选法、α-互补筛选法、营养缺 陷型筛选法等 2、基于目的基因序列的筛选与鉴定 ，如PCR鉴定法、核酸杂交法、酶切法、测 序法等 3、基于目的基因表达产物的筛选与鉴定 ，如western等 4、基于报告基因的筛选与鉴定 ，如荧光蛋白基因或酶基因 抗药性筛选 1、常用的抗生素筛选剂有 ：氨苄 青霉素 （ampicillin ，Amp ）、卡 那霉素 （kanamycin ，Kan ）、氯 霉素 （chloramphenicol ，Cmp ）、 四环素 （tetracymic ，Tet ）、链 霉素 （strentomycin ，Str ）等。 α-互补筛选法 MCS lacZ β α β-半乳糖苷酶的α肽段 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D半乳糖苷 蓝色化合物 X-gal α-互补筛选法 质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因 （lacZ ）,当外源DNA插入到它的lacZ ，可造 成表达后的β-半乳糖苷酶失活 ，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落 在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大 肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列编码β-半乳糖苷酶的β肽段 ，质粒载体 中lacZ基因编码β-半乳糖苷酶的α肽段 ，当质粒转入受体菌后 ，可形成具有 酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这 一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫a-互补。利用这个特性进行 筛选的方法叫a-互补筛选。 营养缺陷筛选法 营养缺陷是指大肠杆菌菌株突变后 ，丧失了合成某种营养素的功能 ，因此 ， 若要在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长。如果外源基因能够实 现其功能的互补 ，重组DNA转化到大肠杆菌宿主细胞之后 ，则它所表现出来 的表型性状则作为重组子筛选的标记。 PCR扩增法 使用载体的通用引物或外源目的基因的特异性引物或两者结合进行PCR扩增。 特异性引物 通用引物 核酸杂交法 菌落原位杂交 酶切法 M 1 2 M ：Marker ；1 ：重组子 ；2 ：双酶切产物 western法 外源目的片段表达之后产生 蛋白质 ，使蛋白的电泳条带 从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上 ，然 后紧密结合 ，结合上的蛋白 质随后能用多种特异的蛋白 配基反应来分析。