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毕赤酵母表达系统 + Mut 和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1 及AOX2 ，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物，甲 醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30% 以上。AOX1 基因调控分两步： 抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此， 用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1 基因 达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1 基因可辨表达水平所必需的。AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动 子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2 基因与AOX1 基因有97% 的同源性，但在甲醇中 带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。在YPD(酵母 膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts 其在对数期增殖一倍的时间大约为2h 。Mut+和Muts 菌 株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4 至6 个小时，Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为 18 个小时。 菌株GS115、X-33、KM71 和SMD1168 的区别 GS115、KM71 和 SMD1168 等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使 蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71 、SMD1168 在组氨酸脱氢酶 位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可 -8 以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10 。GS115 表型 为Mut+ ，重组表达载体转化GS115 后，长出的转化子可能是Mut+ ，也可能是Muts(载体取代AXO1 基因) ，可 以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和GS115 类似，但SMD1168 基因组中的Pep4 基因发生突变， 是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33 由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33 与GS115 一样都是属于MUT ＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71 的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型 ARG4 基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1 基因的BamHI(AOX1 基因15/16 密码子)及SalI(AOX1 基因227/228 密码子)位点，取代了 AOX1 基因 16-227 密码子，此结构转化至 KM71 亲本菌(arg4his4) 中，分离产生 KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1 被aox1::ARG4 结构所取代，所以KM71 所有转化子 都是Muts 表型。AOX1 位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1::ARG4 结构， 这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。但仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4 突变的影响，arg4 菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71 中通过取代aox1::ARG4 结构来获得His ＋转化子。 一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Muts 细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白 量相对较多，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+) 的 细胞都可应用。 基因重组 Pichia. pastoris 酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架 整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。细菌内同源 重组被认为是重组质粒构建过程的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转 移载体必须用特定的限