a549细胞培养方案——适用于各种细胞培养.docxVIP

精选文档 A549 细胞的培养 A549 细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培 养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以 1：2～1：3 传代培养 都是可行的。 一、 [ 所需溶液 ] 1， 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液 (PBS)——无 Ca、Mg NACL 8.00g ； KCL 0.20g; 2 4 0.20g; KHPO Na2HPO4. 。12HO 1.15g 加水至 1 000mL, 将 PH调至 7.4 ，高压灭菌。 2， 消化液 1）胰酶-PBS 结晶胰酶 2.5g; 高压灭菌后的 PBS 1000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀， 使其完全溶解， 通过 0.22 μm的滤膜过滤除 菌，分装备用，放置— 20℃保存。 2）胰酶— EDTA: 结晶胰酶 0.5g; EDTA盐溶液 0.2g 无 Ca、Mg PBS 1 000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀， 使其完全溶解， 通过 0.22 μm的滤膜过滤除 1 / 5 精选文档 菌，分装备用，放置— 20℃保存。 3， 细胞培养液： RPMI 1640培养液 配制方法： 1）将一袋干粉型 RPMI 1640 培养基溶于 900ml 三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。 2）加入丙酮酸钠 0.1g ，NaHCO22g 以及双抗，加入磁力搅棒并置 于磁力搅拌器上充分搅拌。 双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和 100U/ML 链霉素。 ( 一般市售的青霉素为 80 万 U/ 瓶，将其溶解于 4ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml ；市售的链霉素为 100 万 U/ 瓶，将其溶解于 5ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml) 。 3）调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察ＰＨ７ . ２～７ . ４即可。 4）过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ ２加压过滤，０. ２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。 5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置— 20℃保存。 二、［细胞的维持和培养］ １， 细胞的复苏 （１） 准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ ５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇 动使其迅速融化。 （２） 1000～２ 000 r ，3～５ min 离心。 2 / 5 精选文档 （３） 在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打 开冻存管，注意动作要轻柔。 （４） 用 1ml 枪头将上清液去除，加入 1ml 预热的细胞培养液将 2 细胞吹散开，转移至 25cm培养瓶中。 （５） 补充 4ml 的 RPMI 1640培养基，并且添加 10%的胎牛血清。 （６） 倒置显微镜下观察， 37℃、 5%CO2培养。 （７） 24h 后，更换新的培养液。 （８） 常规传代培养。 ２， A549 细胞更换新的培养液 （１） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 （２） 用 PBS反复冲洗细胞 2～3 遍。 （３） 加入新鲜的预热好的培养液及 10%的胎牛血清。 各种液体需要量（ ml） 表面积 25cm 2 75cm 2 2 150cm 洗涤 3 5 10 胰酶 1 ～2 1 ～3 2 ～5 培养液 5 10 20 （４） 倒置显微镜下观察， 37℃、 5%CO2培养。 ３， A549 细胞的传代 （１） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 （２） 向已经长满的细胞中加入消化液 1ml，轻轻摇动培养瓶， 使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表 3 / 5 精选文档 面 2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。 （３） 加入 1ml 消化液，在 37℃培养箱中孵育 5～８ min 后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 （４） 加入 5ml 预热至 37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。 2 （５） 吸取一半的细胞悬液， 接种到新的 25cm 培养瓶中，补足培养液，并且添加 10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为 5～10ml。 （６） 倒置显微镜下观察， 37℃、 5%CO2培养。 注意事项 ： （１） 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37℃。所有液体均应 调整 PH至 7.2 左右，均不能超过 7.4 。 （２） 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多， 否则会损伤细胞。 （３） 严格执行无菌操作的要求。 （４） 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可 多添加些含牛血清的培养液中和。 （５） 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。 ４， A549 细胞的冻存 （１） 消化已生长融合的单层细胞。 4 / 5 精选文档 （２