race原理及其应用.docx

RACE 的简介 目前，全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经 有多种方法可以获得基因的全长序列， 但在很多生物研究中，由于所研究的目的 基因丰度较低，从而使得由低丰度 mRNA 通过转录获得全长 cDNA 很困难。 近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得 全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。 cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术是一 种 基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点， 扩增基因转录本的未知区域，从而获得 mRNA(cDNA) 完整序列的方法。简单 的说就是 一种从低丰度转录本中快速增长 CDNA5和CDNA3末端，进而获得 获得全长 cDNA 简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点，可 同时获得多个 转录本。因此近年来 RACE 技术已逐渐取代了经典的 cDNA 文 库筛选技术，成为克 隆全长 cDNA 序列的常用手段。 第二 RACE 的原理 RACE 是采用 PCR 技术由已知的部分 cDNA 顺序来扩增出完整 cDNA5 和3末端，是一种简便而有效的方法， 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR和 单边 PCR(one2side PCR。) 3 RACE的原理 加入 oligo(dT)17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到 (-)cDNA； 以oligo(dT)l7和一个 35bp的接头(dT17-adaptor)为引物， 其中在引物 的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知 cDNA末 端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物 (3 amp)与少 量第一链 (-)cDNA 退火并延伸，产生互补的第二链 (+)cDNA。 利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链。扩增 的特异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补．而用接头引物来取 代dT17 一 adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。 TTTTTRT w*rth ancHof prim*rTTTTTD*rwHkJF?L O4TVIMI.I mivi rLAl avriSii* :ahe■穴 TTTTT RT w*rth ancHof prim*r TTTTT D*rkalur*. euno*al ■npefwH prim*f 图1 rRA(JE的爲理图 5 RACE的原理 5 RACE与 3RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基 因特异引物 GSP-RT;其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用 GSP-RT逆转录mRNA获得第一链(-)cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和 dATP在cDNA5端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA，接下来 与3 RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物 (5amp)进行PCR扩增。 ■ RnA静T jRiHPr dOlA ?4h g ■?*?)! B?nT # pwdW cDHA vB?RyiHRVt*1r?C4MrMA rilMqi X 4RCRNF MwB 】5 RA€E BWKJ* BV^duaOfUtf HKl ■ RnA 静T j RiHPr dOlA ?4h g ■?*?)! B?n T # pwdW cDHA vB? RyiHRVt*1r?C4MrMA rilMqi X 4RCRNF Mw B 】5 RA€E BW KJ* BV^dua OfUtf HKl 全长cDNA的获得 通过RACE方法获得的双链 cDNA可用限制性内切酶酶切和 southem印 迹分析并克隆。通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性 内切酶 和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的 cDNA产物不 能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆?从而增加 了克隆的选择效 率。还可以用在基因特异性引物的 5端掺人一个限制性内切 酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的 3和5 RACE 产物中获得全长cDNA。或者通过分析 RACE产物的3和5端序列，合成相 应引物来扩增 mRNA的反转 录产物，从而获得全长 cDNA。 第三RACE的应用 RACE技术主要是应用于对全长 cDNA序列的获得，但对该技术进行一定 的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。 首先，RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。Belyavaasky等(1989) 用10个骨髓瘤细胞分离的总 RNA，通过TdT加同聚尾、(dT)16引物反转录， 接着 用(dC