病理检验技术、教学服务模块 1.免疫荧光组织化学技术、课件 免疫荧光染色间接法.pptx

职业教育医学检验技术专业教学资源库免疫荧光染色间接法讲师：李红岩单位：沧州医学高等专科学校免疫荧光染色间接法原理激发光(紫外光)照射荧光素发出可见荧光第二抗体与第一抗体结合第一抗体与组织抗原结合654321加入荧光素标记的第二抗体形成有荧光素的抗原-抗体结合物荧光显微镜观察良性病变的细胞学形态检测试剂盒 没有专门做免疫荧光染色的检测试剂盒,通常是根据所用的一抗选择单一的荧光素标记二抗。目前可供选择的主要有标记FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及 TRITC标记的抗兔和抗鼠二抗,必要时还可以选择非免疫正常血清,可供选择的封闭用正常血清有羊、兔和马血清。免疫荧光染色直接法染色步骤石蜡切片脱蜡至水,冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。必要时石蜡切片进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。必要时进行正常血清封闭10分钟,甩去血清,不洗。滴加一抗工作液孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。免疫荧光染色直接法方法评价PBS洗5分钟,3次。滴加荧光素标记二抗孵育30分钟,37℃。PBS洗5分钟,3次。晾干或甩去PBS用缓冲甘油封片。免疫荧光染色直接法结果阳性结果荧光呈明暗不一的亮黄绿色(FITC标记二抗)或橙红色( TRITC标记二抗)。免疫荧光染色直接法结果在染色中加入荧光素标记的二抗与一抗结合,使抗原一抗体结合物不断放大，敏感性较高。一抗不需标记荧光素,和免疫组化染色一样可选择的一抗种类多,用一个检测试剂盒就可以分别检测各种抗原。间接法除了用冷冻切片外,还可以用石蜡切片。免疫荧光染色间接法荧光显微镜的使用1.要提前打开荧光显微镜电源,超压汞灯开启15分钟后光源稳定,适合观察。开启光源后每次使用不超过2小时,超过2小时光亮强度逐渐下降,观察到的荧光也会变弱。关闭光源后需要等灯泡冷却后才能再次开启,否则影响灯泡寿命。2.荧光显微镜应安装紫外光挡板或在观察时戴上防护眼镜,防止紫外光损害眼睛。3.用高倍油镜观察时,应选用无荧光镜油,避免非特异性荧光干扰。4.拍摄荧光图像时,应选用较高的ISO感光度模式。免疫荧光染色间接法免疫荧光染色质量控制免疫荧光染色质量控制与免疫组织化学染色质量控制基本相同。?此外,?免疫荧光染色后,染色片放置时间长荧光会慢慢衰减,因此,应及时观察,否则荧光衰减会导致阳性强度的错误判断或出现假阴性。?观察时,?光源长时间照射标本,?会加快荧光淬灭,?应避免长时间观察同一标本。?如果用石蜡切片行免疫荧光染色,?则必须彻底脱蜡,?否则石蜡会有青色荧光发出,影响观察。免疫荧光染色间接法讨论免疫荧光染色间接法的原理。免疫荧光染色间接法的优缺点。谢谢大家